王加冕，马小军，张小丽，时帅峰

(甘肃农业大学动物医学院，甘肃 兰州 730070)

动物乳房炎是世界各地养殖业的常见疾病，全球奶牛乳房炎平均发病率约为50.00%，我国奶牛乳房炎的阳性检出率高于全球平均水平，达到46.40%～85.70%[1].乳房炎会使母畜泌乳量下降、奶汁品质降低、最终导致淘汰率上升、治疗费用增加等，影响养殖场经济效益的同时对人类食品安全造成严重威胁[2].奶牛乳房炎的众多致病因素中，病原微生物侵入导致乳房炎的发生最为常见[2]，临床上引起乳房炎的主要病原菌包括金黄色葡萄球菌、大肠杆菌及链球菌，这3种病原菌占乳房炎病原菌总数的90%～95%[3-4].

大肠杆菌属革兰氏阴性菌，具有多种毒力因子，如内毒素、外毒素和黏附素等，其中内毒素是大肠杆菌主要的致病毒力因子，能够引发动物机体强烈的炎症反应[5]，所以当母畜发生大肠杆菌性乳房炎时，多为急性炎症过程.一方面，在炎症反应中，乳腺上皮细胞发生损伤、脱落，使乳腺组织受到损伤，大大降低产奶量，严重者诱发败血症，导致动物的急性死亡，且大肠杆菌属于环境性致病菌，可在动物粪便中生长、繁殖，导致群体中乳房炎的传播，严重危害养殖业经济效益.另一方面，大肠杆菌可通过患病羊的乳汁传播，人类摄入消毒不当的病羊乳汁，可患腹泻及败血症，严重影响人类健康.故查明大肠杆菌在乳房炎中的感染情况及耐药性，可有效控制乳房炎发生.

近年来，甘肃省大力推进生态养殖业的建设，舍饲养殖业已成为农民重要的收入来源[6].目前由于基础设施不够完善、舍饲条件管理有限、农民养殖知识薄弱等不可避免因素的影响，绵羊乳房炎成为当地最常见的疾病之一，一直困扰着养殖业的发展[7-8].为了查明大肠杆菌在舍饲绵羊乳腺组织中的感染情况及其耐药性，本试验采集甘肃省永昌县临床型乳房炎患羊乳样进行病原菌的分离鉴定和药物敏感性试验，研究结果可为该地区乳房炎的预防治疗提供参考和依据.

1 材料与方法

2.1 试验材料

2.1.1 培养基、试剂及试验动物 麦康凯培养基、伊红美兰培养基(北京奥博星)；鲜血琼脂培养基、普通营养肉汤培养基、普通营养琼脂培养基(自制).细菌基因组DNA提取试剂盒、16s rRNA通用引物(南京诺唯赞)；抗菌药物药敏纸片(北京天坛)；细菌微量生化反应管(上海化科).SPF小白鼠(体质量18～20 g/只)，购于兰州大学实验动物中心.

2.1.2 仪器设备 电子分析天平(瑞士 METTLER TOLEDO)、光学显微镜(日本尼康)、高速离心机(德国 Eppendorf)、超净工作台(上海智城)、卧式恒温振荡器(美国 CRYSTAL)、恒温培养箱(上海跃进)、PCR扩增仪及凝胶成像分析仪(美国 BIO-RAD)、电泳仪(北京六一)、常规仪器设备等.

2.2 试验方法

2.2.1 乳样来源 采自甘肃省永昌县某舍饲绵羊养殖场的16份临床型乳房炎患羊乳样.

2.2.2 分离培养 充分摇匀无菌采集的乳样，接种于50 mL/L的鲜血琼脂培养基上，37 ℃恒温培养箱培养18～24 h，观察细菌生长情况.根据菌落的形态特点，挑取多个典型单菌落进行革兰氏染色、镜检.根据细菌生长情况、菌落形态特征及染色特性，选择革兰氏阴性、无芽孢杆菌接种于麦康凯琼脂培养基和伊红美兰琼脂培养基上进行选择性培养，进一步观察培养特性及染色特性，反复操作，直至纯化为单一菌株后移至斜面保存[9].同时接种于鲜血琼脂平板，观察其溶血现象.

2.2.3 生化鉴定 生化鉴定采用细菌微量生化反应管进行，生化培养参照伯杰氏细菌鉴定手册进行，将分离菌株接种至不同的细菌微量生化反应管中，37 ℃培养24～48 h或更长时间后观察试验结果.

2.2.4 16s rRNA序列分析

2.2.4.1 细菌模板DNA的提取 利用细菌基因组DNA提取试剂盒提取菌株的DNA，-20 ℃保存.

2.2.4.2 PCR扩增 以提取的细菌DNA为模板，用细菌16s rRNA通用引物进行PCR(聚合酶链式反应)扩增[10]，PCR扩增反应体系：GreenTaqMix(dNTP、Taq、核酸染料)12.5 μL，上、下游引物各1 μL，DNA 0.5～1 μL，DD水10 μL，加至管底，震荡均匀，离心后进行扩增.PCR扩增反应条件：预变性94 ℃，5 min；变性94 ℃，30～60 s；褪火58 ℃，30 s；延伸72 ℃，90 s；终止72 ℃，7 min；保存16 ℃.变性、退火和延伸重复30～35个循环，PCR扩增产物4 ℃保存.

2.2.4.3 PCR扩增产物的检测 取4 μL PCR产物，进行2%琼脂糖凝胶电泳，用凝胶成像分析系统进行分析.

2.2.4.4 PCR扩增产物序列分析 PCR产物送往测序公司进行序列测定，测序结果提交NCBI(美国国立生物技术信息中心)进行BLAST序列比对分析[11].

2.2.5 动物试验 将分离鉴定的大肠杆菌纯培养物接种于血清肉汤，37 ℃培养24 h.对照组小白鼠腹腔注射生理盐水；试验组每只小鼠注射菌悬液0.5 mL(OD600=1)，注射3只小白鼠.注射后各组小鼠隔离饲养，观察小鼠的发病和死亡情况并做记录.死亡小鼠及时剖检、观察病变组织的病理学变化，同时从发病或死亡小白鼠的肝脏或脾脏无菌采集标本，进行细菌的分离鉴定.

2.2.6 大肠杆菌的药敏试验 挑取已鉴定过的菌株于普通肉汤中，37 ℃摇床振荡培养8 h，选取与0.5号麦氏标准管浊度相同的菌液进行药物敏感试验[12].吸取200 μL菌液，滴加于琼脂固体培养基表面，平板涂布均匀，静置片刻.镊子夹取药敏纸片，按一定距离平放于平板上，纸片贴后静置15 min，培养皿倒置37 ℃培养16～18 h.培养完成后用游标卡尺测量药敏纸片的抑菌环直径并做好记录，参考世界临床实验室标准委员会(NCCLS)推荐的纸片扩散标准[13]，判定细菌对药物的耐受程度.

3 结果与分析

3.1 分离菌株培养及染色特性

在16份临床型乳房炎患羊乳样中，分离得到2株疑似大肠杆菌的菌株，2株分离菌株均不溶血，它们在麦康凯琼脂平板上形成粉红色的菌落(图1-A)，在伊红美兰琼脂平板表面形成有金属光泽的墨绿色菌落(图1-B).

对疑似菌株进行涂片、染色，显微镜观察的结果表明2株疑似菌株均为两端钝圆、中等大小、单在的革兰氏阴性无芽胞杆菌，如图2所示.

图1 疑似菌株在选择培养基上的生长表现Figure 1 Growth of suspected strains on selective media

图2 疑似菌株的染色特性Figure 2 Staining characteristics of suspected strains

3.2 分离菌株的生化鉴定结果

根据分离菌株的染色和培养特性，设计相关生化试验进行初步鉴定，生化反应结果见表1.结合形态学特性、培养特性及相关生化试验结果，初步判定分离菌株1、2均为大肠杆菌.

3.3 分离菌株16s rRNA序列分析结果

3.3.1 分离菌株16s rRNA基因片段PCR扩增 以提取的分离菌株基因组DNA为模板，用特异性引物对2株分离菌的16s rRNA基因进行PCR扩增，PCR产物进行2%琼脂糖凝胶电泳，2株分离菌均在约370 bp处出现一条特异条带，与预期扩增片段的大小一致，说明扩增成功(图3).

3.3.2 分离菌株16S rRNA序列分析 将测得序列提交NCBI进行BLAST分析，结果如图4所示，2株分离菌的16s rRNA的基因序列与大肠杆菌的同源性达到99.9%，证实该菌为大肠杆菌.

3.4 动物试验结果

选一株鉴定过的大肠杆菌进行小白鼠的人工感染试验，结果表明感染大肠杆菌的小白鼠在18～24 h内全部死亡，剖检见十二指肠膨胀，呈半透明状，肠壁变薄，肠内充满黄色稀薄的内容物，其余内脏器官未见明显病变(图5)；对照组小白鼠均正常.从小白鼠的脏器组织分离得到了与已鉴定菌株一致的大肠杆菌.说明此次分离的大肠杆菌具有很强的致病性，揭示大肠杆菌也是引起永昌县舍饲绵羊临床型乳房炎的重要病原菌.

表1 疑似菌株的生化反应结果

3.5 大肠杆菌的药敏试验结果

选用红霉素、链霉素等抗菌药物对分离的大肠杆菌做药敏试验，18 h后测量其抑菌圈直径，图6为大肠杆菌对环丙沙星、氨苄西林、链霉素、诺氟沙星的药敏试验结果.

大肠杆菌对不同抗菌素的药敏试验结果见表2.永昌县舍饲羊场分离得到的大肠杆菌对卡那霉素、新霉素、阿米卡星、氯霉素和庆大霉素高度敏感，对万古霉素、青霉素G和氨苄西林低度敏感甚至不敏感.

M：DNA分子质量标准；1～6：分离菌株16s rRNA基因片段.M：DNA molecular quality standard；1～6：Isolate 16s rRNA gene fragment of strain.图3 分离菌株16SrRNA基因片段PCR扩增结果Figure 3 The result of PCR amplications of isolates 16s rRNA genes

图4 分离菌株序列比对结果Figure 4 Results of sequence alignment of isolates

4 讨论

据有关资料报道，引起奶牛乳房炎的病原微生物种类繁多，临床上以链球菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌感染引起的乳房炎最为常见，其中大肠杆菌通过侵入动物乳房引发大肠杆菌性乳房炎，主要发生在宿主免疫受到抑制时的围产期和泌乳早期.

近年来，关于从畜群乳房炎中分离出大肠杆菌的文献报道很多.张磊等[14]对河北省某奶牛场中采集患羊乳汁，分离到的大肠杆菌对卡那霉素、菌必治敏感，对莫能菌素、林可霉素、氨苄青霉素、链霉素、苯唑青霉素、阿奇霉素表现出耐药性；马晓媛等[15]在吉林地区乳房炎中分离到的大肠杆菌对阿奇霉素、头孢噻呋、阿莫西林、氨苄西林、链霉素、磺胺异噁唑、萘啶酸等完全耐药，且不同奶牛场和不同标本中分离的大肠杆菌对常用抗菌药物的耐药性有着不同的特点；廖智慧等[16]对河北衡水地区奶牛乳房炎源大肠杆菌进行了耐药性分析，结果表明分离株仅对头孢克肟、恩诺沙星、丁胺卡那、强力霉素4种药物敏感；武军元等[17]从新疆阿克苏地区奶牛乳房炎分离的大肠杆菌对氨苄西林的耐药性最高，多西环素、四环素和链霉素的耐药性次之；石润佳等[18]在华北地区乳房炎奶样中分离到的大肠杆菌对青霉素、苯唑西林、林可霉素耐药率高达100%；张金宝等[19]在宁夏地区检测到乳房炎源大肠杆菌对氨苄西林的耐药率最高；本研究从甘肃省永昌县16份临床型乳房炎患羊的乳样中共分离、鉴定得到2株大肠杆菌，药敏试验结果表明2株大肠杆菌均对卡那霉素、新霉素、阿米卡星、氯霉素和庆大霉素高度敏感，对万古霉素、青霉素G和氨苄西林低度敏感甚至不敏感，与其他地区对比大肠杆菌的耐药性有所不同，这可能与不同地区、季节、泌乳期、饲养管理水平、卫生状况、个体抗病能力以及常用抗菌药物等原因的影响有关.

图5 大肠杆菌致死小鼠Figure 5 E.coli infection killed mice

图6 大肠杆菌的药物敏感试验Figure 6 Antibiotic sensitivity tests of E.coil

表2 大肠杆菌药敏试验结果

目前国内对于乳房炎以预防指导、改善饲养条件和抗生素治疗为主，这些方法对于降低乳房炎的发病率和减轻乳房炎的严重程度都十分有限，并且由于治疗人员缺乏医疗知识与用药指导，出现了抗生素滥用、乱用以及大剂量使用的现象，致使致病菌产生了越来越强的耐药性，为乳房炎的有效治疗增加了难度[20-21].在绵羊养殖过程中，应坚持预防重于治疗，并合理规范化的进行饲养管理，提高羊群的免疫力，从源头解决乳房炎发病率高的问题.另外，我们要加强对隐形乳房炎的监控检测，早发现早治疗，对于患病动物应及时隔离，避免传染给其他动物.只有防治结合，才能有效地控制乳房炎的发生，才能为养殖业的良好发展打下夯实的基础.

5 结论

大肠杆菌是引起甘肃省永昌县舍饲绵羊养殖场临床型乳房炎的致病菌之一，由药敏试验结果可知，永昌县所有分离菌株均对卡那霉素、新霉素、阿卡米星和庆大霉素高度敏感，对万古霉素、青霉素、氨苄西林不敏感，甚至完全耐药.对比其他地区，分离得到的大肠杆菌耐药性的不同可能是由于用药方式、地域特点、光照、温度、海拔、饲养方式和湿度等因素造成的.