龚光禄，桂 阳，黄万兵，杨通静，卢颖颖，刘宏宇，郎柳录，朱国胜

(1.贵州省农科院农作物品种资源研究所/贵州省食用菌育种重点实验室/贵州省农业科学院食用菌研究中心，贵阳 550006；2.贵州利康农科技有限公司，贵阳 550006)

红托竹荪(DictyophorarubrovolvataM. Zang et al.)，又名织金竹荪，隶属鬼笔科(Phallaceae)、竹荪属(Dictyophora)真菌[1]，为贵州最具特色的食用菌之一，是全省种植的重要品种。野生资源主要分布于贵州、云南等竹林下的腐殖土上，主产于贵州。红托竹荪风味独特、营养丰富、价值高，而且子实体含有丰富的多糖[2]，具有较强的还原能力和抑制羟基自由基能力，同时具有明显的体外抗氧化活性[3,4]，红托竹荪菌托中多糖组份DRVP 1对小鼠S 180肉瘤具有一定的抑制作用[5,6]。因此，该菌具有较高的食用保健价值，是食用菌中的佳品，有“蘑菇皇后”、“真菌之花”等美誉。

因其菌丝生长缓慢、遗传稳定性差、易退化，导致菌种很难传代培养[7]。每年的菌种都要从野生资源或栽培资源中分离获得，因菌株间的遗传差异或者变异[8]，使得市场上生产流通的菌种较为混乱，且稳定性差，导致红托竹荪产业产量不稳定、品质波动大，还没有形成稳定的、贵州适栽的品种。因此，开发优良菌种对贵州省红托竹荪产业的发展至关重要。

本研究对贵州省内红托竹荪野生主要分布区和栽培主产区，通过资源调查与收集，共分离获得56个菌株，进入室内保藏与评价时，部分菌株传代培养不萌发，淘汰了26个菌株，剩余40个菌株开展相关试验。拟通过室内评价、室外栽培，通过菌丝长速、长势、拮抗以及农艺性状综合评价，筛选出贵州的适栽优良菌株用于生产。

1 材料与方法

1.1 供式菌株

红托竹荪菌株由贵州省农科院农作物品种资源研究所(贵州省食用菌育种重点实验室)提供，共40个菌株，其中35个野生菌株、5个为栽培菌株，见表1。

1.2 方 法

1.2.1母种培养特性试验

将供试菌株在PDA培养基上活化，以保证试验中菌龄和接种量一致。取活化后0.5 cm2的菌种块接种到PDA综合培养基平板中央，在25 ℃恒温、避光培养。试验设3个重复，每天记录菌丝生长速度、长势、菌落边缘特征等。当生长速度最快的菌株即将长满平板时取出，测定菌落半径，并对菌丝生长速度进行差异显著性分析，筛选菌丝长势较好的菌株。

1.2.2拮抗试验

在无菌条件下，随机将1.2.1筛选获得的长势较好的菌株进行拮抗实验，对峙接种于PDA综合培养基平板上，置于25 ℃恒温箱中进行对峙避光培养，观察有无拮抗反应，合并无拮抗反应的菌株，筛选有差异的菌株。

表1 供试红托竹荪菌株及来源

1.2.3原种培养特性试验

将筛选得到的差异菌株接种到木屑原种培养基中，木屑培养基装入200 mL的三角瓶，每瓶装150 g，每个品种重复3次，其他方法同常规制种。接种后置于25 ℃恒温避光培养，待菌种定植后，观察菌丝长势、密度等，当生长速度最快的菌株即将长满三角瓶时取出，测定菌丝生长速度并进行差异显著性分析，筛选菌丝长势较好的菌株。

1.2.4优良品种筛选试验

于2015年将1.2.3复筛获得的6个菌株YZS 014、YZS 020、YZS 022、YZS 026、ZS 037、YZS 048与织金县购买的常规栽培菌种为对照菌株，进行栽培品比试验。每菌株栽培1 m2，观察播种后菌丝长势、吃满料时间、菌丝爬土时间天数、原基发生时间、子实体出菇时间，并记录竹蛋特征、子实体特征、商品性状、产量等农艺性状。竹蛋、子实体、商品性状特征等以每个竹蛋或子实体为调查对象，其他农艺性状将把1 m2的区域划分为3块进行数据统计。所有测试结果与对照菌株(ck)进行判定，筛选出优质高产的优良菌株。

1.3 数据处理

菌丝生长速度(mm·d-1)=菌落半径或长度/生长天数。数据统计分析采用SPSS 20.0软件进行分析。

2 结果与分析

2.1 母种培养特性初筛分析

2.1.1菌丝形态特征

通过观察所有菌株菌丝的形态特征可知，在供试的40种菌株中，存在4种菌落形态，如图1所示。边缘整齐、边缘呈丛状、边缘波纹线以及不萌发(图1 A)；菌丝尖端有直生和交叉状生长(图1 B)；显微特征有粗壮分枝少和细密分枝多(图1 C)。且菌落边缘整齐的菌丝尖端直生、粗壮、分枝少，菌落边缘不整齐的丝尖端交叉状生长、细密、分枝多。

2.1.2菌丝生长特性

由不同菌株在母种培养基上的菌丝生长情况可知，在40个供试菌株中，除YZS 003和YZS 051未生长外，其余均有所生长。初选了菌丝生长速度每天大于0.5 mm的17个菌株进行下一步试验，如表2所示。生长速度最快的YZS 014菌株在母种培养基中的速度为1.894 mm·d-1，较其他菌株差异显著；其次是菌株YZS 026、YZS 022、YZS 020和YZS 048，之间差异不显著；再次是菌株ZS 037、YZS 001、YZS 050、YZS 005、YZS 038、YZS 029、YZS 041、YZS 044、ZS 053、ZS 036、YZS 043和YZS 004，它们之间有差异，但差异不显著。

注：A为菌落特征(A 1为边缘整齐；A 2为边缘呈丛状；A 3为边缘波纹线；A 4为不萌发)； B为边缘生长特征(80倍)(B 1为菌丝尖端直生；B 2为菌丝尖端交叉状生长)； C为菌丝特征(1 000倍)(C 1为菌丝粗壮分枝少；C 2为菌丝细密分枝多)。图1 菌丝在培养皿上菌落特征

2.2 拮抗试验分析

将2.1.2初筛的17个菌株进行拮抗试验分析，菌株YZS 014单独为一类，与其他菌株间均存在着拮抗反应；菌株ZS 036、YZS 38、YZS 41间有拮抗但是不明显，可分别为一类；其余菌株YZS 026和YZS 005，YZS 022、YZS 001和YZS 050，YZS 020和YZS 029，YZS 048和YZS 53，ZS 037和YZS 044，YZS 004和YZS 043之间能融合，各为一类，如图2和表3所示。供试的17个菌株间有10种不同的菌株，按照生长速度择优的方法，选择YZS 014、YZS 026、YZS 022、YZS 020、YZS 048、ZS 037、YZS 038、YZS 041、ZS 036和YZS 043这10个菌株进行下一步试验分析。此外，菌株YZS 026、YZS 022、YZS 020和YZS 048虽在母种培养基中的生长特性差异不显著，但拮抗反应表明仍为不同菌株。

2.3 原种培养特性复筛分析

将2.2中选出的10个菌株作为对象，进行原种培养特性分析。如表4所示，除了YZS 014和YZS 026有1瓶被污染外，其余均未被污染；不同菌株在木屑原种培养基中的长势均较旺且雪白，但生长速度在0.05水平上存在较大差异，在0.01水平上除了ZS 036外，其余9个菌株间差异不显著，因此菌株ZS 036被淘汰。

2.4 品比农艺性状终筛分析

将原种复筛中的9个菌株，并与母种培养特性中长势前9的菌株进行对照，发现有5个野生菌株YZS 014、YZS 020、YZS 022、YZS 026、YZS 048和1个栽培菌株ZS 037，同时出现的母种和原种生长速度在前9的菌株。因此，最终以这6个菌株为出发菌株，以织金购买菌株为对照菌株(ck)，进行红托竹荪代料栽培品比试验，通过菌丝生长特性与农艺性状分析最终筛选出优良菌株。

表2 红托竹荪菌丝在母种培养基上生长情况

2.4.1菌丝生长特性分析

将上述菌株栽培种接种到玉米秸秆栽培料中，基质料厚度为20 cm，接种量为2.5 kg·m-2，然后每5 d观察1次菌丝的长势，以及菌丝长满时间，并在第30天左右，对每个菌株的长势，吃料深度进行测量并计算出日平均生长速度。结果如表5所示，在秸秆栽培料中不同菌株均未发现污染情况，且菌丝日平均生长速度为3 mm左右，且差异不显著，一般50～60 d即可长满基质料，菌丝长势以菌株YZS 020和YZS 048较好，表现菌丝洁白、浓密、生长旺盛，爬土强、菌丝束较多，菌株YZS 026和ZS 037较差，表现为菌丝爬土能力弱、菌丝束少。

图2 红托竹荪菌株间的拮抗情况

图3 红托竹荪菌丝在木屑培养基中的生长情况

表3 红托竹荪菌株间的拮抗情况

2.4.2农艺性状分析

6月18日播种，播种后第2天即开始萌发并吃料，8月中旬大部分菌丝长满，开始覆土，10月旬菌丝逐渐出土并纽结形成菌索，并进一步形成原基，原基形成后50 d左右开始破壳出菇，出菇后当天即可采收(如图4)。统计分析了不同菌株的农艺性状，如表6所示，菌株YZS 020和YZS 048能够较快形成原基，且原基数量远远高于对照菌株，有效竹蛋也较高，且只有YZS 020能正常出菇，产量达587.4 g·m-2，YZS 014、YZS 022虽然也出现了原基，但是原基数量较少，且后期会出现干瘪等不正常竹蛋，也不能正常出菇，菌株YZS 026和ZS 037没有原基发生。

表4 红托竹荪菌丝在母种培养基上生长情况

表5 红托竹荪菌丝在栽培基质料中菌丝生长特性

表6 红托竹荪不同菌株的农艺性状

图4 红托竹荪不同菌株在不同生长发育阶段特征

3 讨 论

3.1 结 论

通过在红托竹荪野生资源分布区和栽种主产区收集获得56个菌株，进行传代培养首先淘汰掉不能连续培养的菌株，获得40个菌株。然后逐一进行了母种培养特性的初选分析、筛选17个长势较好，生长速度较快的菌株进行拮抗实验合并无拮抗反应的菌株，获得10个菌株进入到原种生长特性的复筛分析并与初筛结果进行对照，复筛出6个优良菌株进行出菇决筛分析，最终筛选获得2个适栽优良菌株，YZS 020和YZS 048。

3.2 讨 论

菌丝生长速度和生长势是衡量食用菌品种优劣的重要指标之一，试验中母种培养基中生长速度较快的菌株在原种以及基质料中的生长速度并没有明显的优势，且产量并不是很高，如YZS 026和ZS 037，其菌丝长势在母种和原种中的生长趋势并不一致，且菌丝生长较快的菌株YZS 014在品比实验中其农艺性状与产量并不好。说明菌丝体生长速度与产量相关性不明显，不能用其预测产量，这与王振河等[9]、杜萍等[10]的研究结果相一致。同时也说明在母种培养基上菌丝长势好的菌株不一定在原种、栽培种中长势也好，因此也不能用母种菌丝的长势来预测原种的长势。