徐丽丽，刘书涵，李世伟，康绍玲，王敬国，付俊生，韩 笑，孙 健

(东北农业大学农学院，黑龙江 哈尔滨 150030)

水稻是全球近半数人口的主要粮食作物。有色稻米是特种稻米的重要成员，由于其果皮和种皮内堆积了大量色素，糙米可呈现绿、褐、红、红黑、乌黑、紫黑、黄等多种颜色[1,2]。有色稻米的营养成分较白米更为丰富，不仅含有较多的蛋白质和氨基酸，还含有比普通白米更多的维生素和矿质元素[3,4]。研究表明，褐色稻米种皮富含铁和锌，棕色米的种皮中含有黄酮类物质，红米的种皮中含原花青素较多，黑米的种皮富含花青素[5-7]，而上述物质在普通白米中的含量均非常低。世界部分地区的人群由于贫困不能购买富含多重营养的食物而出现营养缺乏症，作为主食的稻米价格则相对低廉，大多数人都可以接受。早在1992年，联合国粮农组织与世界卫生组织开始对东南亚地区以水稻作为主食的人群的营养缺乏症加以关注，并且和多个组织合作开展了包含有色米在内的功能稻相关遗传育种研究[5]。

SSR分子标记又称微卫星，因其简便快速、重复性高、可靠性强、稳定性好且具有共显性等特点被广泛应用于水稻的多种研究领域，在遗传多样性分析和遗传图谱构建分子标记辅助选择等方面都做出了贡献。张晓丽等[8]利用72对SSR引物分析316份东南亚国家的水稻品种并得出了后期选配亲本的依据；应杰政等[9]利用24个SSR引物对63个常规主栽品种进行分析，通过聚类分析发现了其品种明显的地域分布特点；马静等[10]利用82对SSR引物分析59份宁夏水稻品种，发现宁夏水稻遗传基础狭窄，应当加大引进新亲本材料的力度；玄英实等[11]利用68对SSR引物对东北地区91份粳稻品种进行分析，发现东三省的粳稻遗传基础狭窄；孙健等[12]利用42对SSR引物分析80份黑龙江省主栽水稻品种，发现黑龙江省大部分水稻主栽品种遗传背景相似，并对后续水稻育种提出展望。黑龙江省是中国水稻的重要产区，但针对有色稻米的研究较少。本研究对黑龙江省部分有色稻米种质资源进行遗传多样性分析，以期为黑龙江省有色稻资源的有效利用及育种的亲本组配提供参考。

1 材料与方法

1.1 材 料

供试材料为41份黑龙江省部分有色稻种质资源和1份云南有色籼稻资源鸡血糯，共42份材料。材料的名称与糙米颜色详见表1。

表1 供试的42份水稻种质资源名称及其糙米颜色

1.2 方 法

1.2.1DNA提取

取42份水稻样品3～4叶时期的叶片，用改进的CTAB法[13]提取水稻基因组DNA。

1.2.2多态性引物的筛选

用供试的42份水稻样品对500对SSR引物进行筛选，选出具有多态性的引物以备后续实验使用。

1.2.3PCR扩增及聚丙烯酰胺凝胶电泳检测

PCR扩增过程选用10μL的反应体系，成分包括：5μL 2×TaqMaster Mix(Dye)；Forward Primer 0.04μL；Reverse Primer 0.04μL；Template DNA 0.01μg；ddH2O 3.91μL。PCR反应在eppendorf PCR仪器中进行，程序为：于94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，循环数为35，72 ℃延伸6 min后于4 ℃保存。PCR 产物在6%的聚丙烯酰胺变性胶上电泳，银染法检测。

表2 供试42份有色稻米种植遗传多样性分析结果

1.2.4数据分析

SSR是共显性分子标记，对于同一对引物扩增出的不同条带可代表同一基因位点上不同的等位基因。分子标记数据经过整理之后使用PowerMarker V 3.25软件[14]对每个SSR引物位点的主要等位基因频率(Major Allele Frequency)、基因型(Genotype No)、等位基因(Allele No)、基因多样性(Gene Diversity)以及多态性信息含量指数(PIC)进行分析。使用NTSYSpc软件[15]进行聚类分析，并计算供试材料之间的相似系数。

2 结果与分析

2.1 扩增片段多态性分析

共检测到224个等位基因，平均每个标记检测到3.86个。主要等位基因频率的变化范围为0.523 8～0.976 2，在筛选出的58对SSR引物中，RM 131、RM 220、RM 223、RM 278、RM 315、RM 1261、RM 1271、RM 1300等40个引物的主要等位基因频率较高，超过0.9；RM 24607的主要等位基因频率最低，为0.523 8。对基因型数量的分析中除RM 488、RM 584、RM 11273为3外，其余引物的基因型数量均为2。RM 24607和RM 1379的基因多样性最高，超过0.4，RM 131、RM 220、RM 223、RM 278、RM 315、RM 1261、RM 1271、RM 1300的基因多样性则最低，为0.046 5。每个SSR位点的遗传多态性信息含量在0.045 4～0.374 4之间，其平均值为0.144 3。其中，以RM 24607的多态性信息含量指数最大，为0.374 4，而RM 131、RM 220、RM 223、RM 278、RM 315、RM 1261、RM 1271、RM 1300的多态性信息含量指数最低，为0.045 4。

图1 供试42个有色稻米品种聚类分析结果

2.2 聚类分析

每对SSR引物检测到的每条多态性带视为1个等位基因，将电泳图谱中清晰的条带赋值为1，无带时赋值为0，缺失时为2，将经过整理的数据利用NTSYS-pc 2.10 e系统软件进行分析，UPGMA聚类分析的结果详见图1。

供试的42份有色稻米品种遗传相似系数在0.21处分为两个大类，第Ⅰ类包含红血糯、鸡血糯、白珍珠稻、紫稻3号、黑稻、黑稻2、黑糯1号、黑甜1号、红糯1号、绥红香、绥098038、海K-9、163761-4、红心米、红壳、小黑稻、紫大粒、7366、早黑2、隆化大红谷欠、大锦、花芒、香芒稻、西红-2、暗红米、一展红-2、92533、AC-1、一展红-1、6 B-7、B 137、黑稻-6、黑紫谷、长芒矮、EB 139、PA 3-1、普优黑珍珠、红香一号、红壳米、L-7共40个品种，第Ⅱ类包含红米一号和圆香黑共2个品种。

其中第Ⅰ类可在遗传相似系数0.53处再分为2个亚类，第1亚类包含红血糯、鸡血糯2个品种，第2亚类包含白珍珠稻、紫稻3号、黑稻、黑稻2等共38个品种，在第1亚类中红血糯和鸡血糯之间的遗传相似系数在0.55～0.57之间。第2亚类品种间遗传相似系数普遍高于0.60，其中部分品种间的遗传相似系数达到0.80以上，如黑糯1号与黑甜1号，西红-2与香芒稻，一展红-2与92533等。

第Ⅱ类包括红米一号和圆香黑2个品种，二者的遗传相似系数未超过0.60。

3 讨 论

随着生活水平的不断提高，生活需求愈发多样化，人们更加追求稻米的营养价值和保健功效等特性，高营养品质的功能性水稻品种的培育日益受到重视。我国加入“WTO”后，农产品市场不断受到冲击，追求稻米的高营养价值和高功效亦是国际市场发展的重要方向[1]。而现阶段我国仍存在优质品种的关键指标优而不全、品种结构类型亟待优化配套，生产技术需加大研发和集成等问题[6]。黑龙江省是水稻的重要产区，但对有色稻品种的研究仍相对较少，审定的有色稻品种难以满足市场需要。且现阶段有色稻米的适口性、加工性等有待改良[17]，仍需继续加大资源创新力度。

参考1980年由Botstein等提出的衡量基因变异程度的多态性含量指标：PIC>0.5则该基因座为高度多态基因座；0.25

黑龙江地区大部分育成品种以虾夷和石狩白毛为共同祖先，遗传基础与其他地区相比仍然比较狭窄[8,9,23]，省内各单位为加快育种进程频繁引种，致使优良性状的骨干亲本被多次反复利用，且由于黑龙江省的地区气候因素，种质单一化程度愈发加剧[12]。水稻的品种遗传多样性低，可能导致水稻产量徘徊、品质和抗性难取得重要突破等现象出现[9]，从而影响稻米品质。应杰政等研究发现，遗传距离较远的材料间组配容易产生强杂种优势[9]，若某品种种内的遗传多样性丰富，其基因变化也会丰富，该物种对环境改变的适应性就越强，进化的潜力就越大。反之适应能力则弱，进化潜力就相对较小[23,24]。本研究显示，供试品种中黑龙江省41个有色稻米品种的遗传多样性丰富度相对较低[8,9,23]，进化潜力相对较小。具有较高营养价值的有色稻的色素基因与落粒性基因、种子萌芽基因连锁，在早年选育品种的过程中往往因其易落粒、种子萌芽率低而将有色米品种淘汰，有色稻的研究价值有待育种工作者发掘。可以通过对有色稻的研究，进一步完善水稻基因组的功能研究[25]。育种工作者仍需加大育种工作的力度，拓宽育种工作的思路。

在后续的育种工作中，应避免或减少亲缘关系过近的品种间杂交，可用亲缘关系较远的品种进行杂交组配。调查显示，在20世纪50年代到80年代的40多年间，整个北方稻区大面积推广的212个早粳稻品种中，有97.2%的选育品种都和日本品种具有亲缘关系[26]。故今后应加大开展在国内外同纬度地区引种的力度，扩大引种范围，如加强与新疆、北美、欧洲等地进行种质资源的交流，从而减少骨干亲本的重复利用，亦可通过生物强化的方式提高稻米中的B族维生素含量[3,7,27]。通过多种途径有望选育出具备杂种超亲优势的营养价值高，保健功能好，适口性好，便于食用加工的新有色稻米品种，让有色稻米被大众的接受程度更高，更广泛地进入日常生活，进而平衡营养摄入，改善饮食结构，通过对主食调整达到全民养生保健。