郑 赟 尹艺臻 温宏伟,2 王 鹏 李贵全*

(1.山西农业大学 农学院，山西 太谷 030801； 2.山西农业大学 小麦研究所，山西 临汾 041000)

在植物衰老过程中，会发生一系列生理生化变化导致叶绿素降解，发生黄化现象，进而使光合作用能力下降， 光合产物的形成量也随之降低，生物量增加变得缓慢直至完全停止[1]。在植株生育末期叶片衰老过程中，会出现叶绿素不降解或降解不明显的情况，叶片和果实仍然保持绿色及较强的光合作用，这种现象称为滞绿(stay-green)[2]。大豆 [Glycinemax(Linn.) Merr.] 种质资源丰富，存在功能型和非功能型2种滞绿突变体。功能型滞绿突变体的叶片衰老机制受损，叶绿素降解和衰老速率减慢，保持绿色，可进行较长时间的光合作用和生物产量的积累，其生物产量及抗逆能力显著高于野生型，这类突变体对提高作物产量具有重要的研究意义。陈骏伯[3]研究发现“持绿型”小麦的叶片具有高光合活性，使合成的同化物持续大量地运输到籽粒中，从而提高产量。白红丹等[4]研究‘科丰14’大豆滞绿突变系，发现突变体成熟后期茎叶和籽粒种皮色均呈现绿色，叶绿素降解较慢，因此大豆滞绿突变体具有提高产量的潜力。非功能型滞绿突变体仅仅是叶绿素降解受到抑制，光合作用仍然随植物衰老而下降，因此是研究叶绿素降解的理想材料。

作为重要的油料、食用和饲料作物，大豆为全世界提供了30%的植物油脂及60%植物蛋白，其营养价值高，含量丰富[5]。大豆蛋白质是重要的植物蛋白，含量高达种子干重的35%～40%[6]，是谷类作物蛋白含量的3～5倍[7]，主要由球蛋白(59%～81%)和白蛋白(8%～25%)组成[8]。大豆蛋白质含有8种人体必需氨基酸，其中除蛋氨酸和半胱氨酸，其他氨基酸含量均达到了世界卫生组织推荐的标准[9]。大豆脂肪含量高达20%[10]，在人体内的营养和消化率极高，是一种重要的优质食用油[9]，主要成分为游离脂肪酸、芳香油、固醇、色素和有机酸脂类等，不含胆固醇[7]，不饱和脂肪酸含量达到了脂肪酸总量的60%左右，其中亚油酸含量占50%以上[11]。因此大豆具有预防高血压、肥胖、糖尿病、骨质疏松和心脑血管疾病等功效[12-14]。

目前，由于作物本身特性及育种水平等因素的限制，我国大豆生产面临着单产、品质水平均较低等严峻问题，严重影响市场竞争力，高产优质大豆的选育受制于生态环境复杂、种质资源匮乏和杂交育种方法单一等因素[5]。相关研究表明大豆产量与品质、蛋白质含量和脂肪含量间都存在一定程度上的负相关[15-16]，对双高品种的创制提出了较大的挑战。大豆滞绿突变体的发现为大豆育种提供了新的研究思路，其独特的叶绿素不降解特性为选育兼顾双高品质及高产大豆品种提供了更多的可能。滞绿大豆的品质性状相关方面的研究鲜有报道。本研究以诱变得到的大豆滞绿突变体M6代为试材，按照种皮色和子叶色进行分类，对各类群体的光合速率、叶绿素含量、蛋白质含量和脂肪含量进行测定并统计分析，并发掘其中潜在的优质品系，旨在阐明滞绿突变体中叶绿素降解和大豆品质的关系以及不同类型大豆光合作用的差异，以期为选育特色大豆、高品质大豆提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

供试材料为大豆滞绿突变体‘Z-94320’(田间自然突变双青豆，来自山西农业大学大豆育种研究室)及其诱变获得的突变体M6代分离群体，总计108个分离单系。滞绿突变体大豆，种皮色和子叶色均为绿色，褐脐，灰茸毛，紫花，尖叶型，亚有限结荚习性，一般有效分枝0～2个，百粒重20.34 g左右，生育期一般在115～120 d，蛋白质含量44.9 g/100 g，脂肪含量21.4 g/100 g。

1.2 试验设计

2012年，在山西农业大学大豆遗传育种试验室中，利用剂量率为100 R/min的60Co-γ射线对滞绿突变体‘Z-94320’的干种子进行辐射诱变处理，获得诱变新种质。

将诱变所得新种质种植于大田，进行连续5代目标性状的自交定向分离筛选，于2017年5月13日在山西农业大学农学院大豆育种试验田种植M5代诱变突变体种子，采收获得108个M6代的诱变突变体分离单系。依次以1，2，…，108进行编号，将各单系继续种植于大田，采用随机区组设计，行长5 m，行距0.5 m，株距0.25 m，重复3次，田间管理采用常规技术。

1.3 测定项目和测定方法

1.3.1叶绿素含量(SPAD值)的测定

用SPAD-502叶绿素测定仪测定M6代群体的苗期、盛花期和衰老期的叶绿素含量，3次重复。测定时，随机选取诱变后代各分离单系3株，选取顶部同一部位叶片测定，每个叶片随机选取3个测量点，取其平均值。

选用叶绿素变化率来表示诱变后代材料的滞绿性，以此更好地说明大豆滞绿突变体后代中不同种皮色(绿、浅绿、黄)滞绿的程度和子叶色(绿、黄)类型在衰老过程中与叶片叶绿素降解的关系，本研究中叶绿素变化率=(衰老期叶绿素含量-盛花期叶绿素含量)/盛花期叶绿素含量×100%。

1.3.2光合参数的测定

大豆进入鼓粒期后，选光线好的晴天， 9：00—15：00用CI-340光合仪测定M6代各分离单系的光合参数，3次重复，光照强度为1 000 μmol/(m2·s)左右。

1.3.3品质性状的测定

成熟后，将M6代植株上收获的籽粒晒干，置于Infratec TM 1241 Grain Analyzer V5.00品质分析仪中，检测籽粒中蛋白质和脂肪的含量，进行3次重复。

1.4 统计分析

用Microsoft Excel对统计记录的数据进行整理，用SPSS 24.0和DPS 6.05软件对数据进行处理分析。

2 结果与分析

2.1 滞绿突变体后代分离系的叶绿素含量比较

滞绿大豆诱变后代群体中出现了丰富的变异(图1和图2)，根据种皮色和子叶色将其分为4种类型，分别命名为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ，其中Ⅰ类种皮色绿色和子叶色绿色；Ⅱ类种皮色浅绿色和子叶绿色；Ⅲ类种皮色浅绿色和子叶色黄色；Ⅳ类种皮色黄色和子叶色黄色。

(a)豆荚颜色的变异；(b)荚粒数的变异；(c)同色豆荚中的不同颜色籽粒 (a) Variation of pod color; (b) Variation of pod number; (c) Different color seeds of the same color pods图1 滞绿突变体后代豆荚的变异Fig.1 Variation of pods in the progenies of stay-green mutants

(a)种皮色变异；(b)籽粒颜色从绿变黄 (a) Variation of seed coat color; (b) Seed color changes from green to yellow图2 滞绿突变体后代的籽粒变异Fig.2 Seed variation of progenies of stay-green mutants

由表1可知，衰老期的叶绿素SPAD值，Ⅰ、Ⅱ类群之间并无明显差异，但是都显著高于Ⅲ、Ⅳ类群，叶绿素变化率在4个类群之间表现出显著差异(P<0.05)。Ⅰ类群叶绿素变化率的范围在-28.57～31.20%，平均变化率为12.27%，其中仅有材料7、58、76和78出现衰老期叶绿素下降的情况；Ⅱ类群叶绿素变化率的范围在-21.62～44.85%，平均变化率为10.85%，其中则出现了较Ⅰ类更多的叶绿素降低情况；Ⅲ类群体中衰老期叶片叶绿素SPAD值较前两类略低，且除8、9、32、43、91号材料其他都表现为下降，平均变化率为-6.39%；Ⅳ类群体中衰老期叶片叶绿素SPAD平均值仅为19.23，该类群的所有材料都表现出正常的下降情况，平均变化率达到-47.42%。因此，将Ⅰ、Ⅱ类群划分为滞绿型，Ⅲ、Ⅳ划分为普通型。

表1 不同类群的衰老期叶片SPAD值及变化率Table 1 SPAD value during senescence and change rate of each group

2.2 滞绿突变体后代分离系的光合作用比较

由图3可知，类群Ⅱ的净光合速率较其他类群显著低于Ⅳ类群，Ⅰ、Ⅲ类群与其他类群的差异并不显著，说明子叶色或种皮色的变化对净光合速率并无影响；Ⅳ类群的蒸腾速率显著高于Ⅰ、Ⅲ类群，Ⅱ类群则与其他类群无显著差异，说明子叶色或种皮色的变化可能对蒸腾速率也并无影响；Ⅳ类群的气孔导度显著高于其他3个类群，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ类群间无显著差异，说明种皮色的变化可能会对气孔导度产生影响；4个类群的细胞间CO2浓度并无差异，说明子叶色或种皮色的变化对胞间CO2浓度没有影响。综合光合作用指标发现除种皮滞绿会造成气孔导度的降低外，子叶滞绿或种皮滞绿对光合作用并未产生明显影响。

小写字母表示差异显著(P<0.05). Lower-case letters indicate significant differences (P<0.05).图3 各类群光合参数比较分析Fig.3 Comparison analysis of photosynthetic parameters of each group

2.3 滞绿突变体后代分离系的品质性状比较

从表2可知，滞绿型后代Ⅰ和Ⅱ类群之间的品质并无显著差异，滞绿型后代的蛋白质含量与普通型后代的差异极显著，脂肪含量则与Ⅲ类群存在显著差异，与Ⅳ类群存在极显著差异。

由图4可知，在蛋白质含量方面，各类群由大到小分别为：Ⅱ>Ⅰ>Ⅲ>Ⅳ，滞绿型类群明显高于普通型类群，其中Ⅰ类群的84号株系总蛋白质含量最高，达到46.5 g/100 g，Ⅳ类群的105号株系含量最低为40.9 g/100 g。在大豆的脂肪含量方面，各类群由大到小分别为：Ⅱ>Ⅲ>Ⅰ>Ⅳ,其中Ⅲ类群的91号株系脂肪含量最高，达到22.1 g/100 g，Ⅳ类群的105号株系含量最低为20.6 g/100 g，滞绿型类群虽然高于普通型，但是Ⅲ类群高于Ⅰ类群的情况也不能忽略，这可能是由于蛋白质含量和脂肪含量存在负相关性的影响，过高的蛋白质积累抑制了脂肪含量的增长。通过与对照株系(CK)的蛋白质含量和脂肪含量相比较，各M6代株系的变化有增有减，但是各类群的蛋白质含量平均水平则表现为全部降低，脂肪含量除类群Ⅳ降低其他三类均为增高。综合来看，滞绿性状对改善大豆品质有显著的影响，蛋白质和脂肪含量同时增加是存在可能的。

表2 各类群品质的的差异显著性分析Table 2 Analysis on the difference of quality of each group

(a)蛋白质含量的变化；(b)脂肪含量的变化 (a) Changes in protein content; (b) Changes in fat content图4 各类群的品质变化趋势Fig.4 Quality change trend of various groups

滞绿突变体生育期叶绿素的变化会影响到植物自身有机物的积累，因此叶绿素变化率和蛋白质、脂肪含量存在一定关系。由表3可知，在滞绿突变体后代中，叶绿素变化率、蛋白质含量、脂肪含量均与衰老期叶绿素含量存在着极显著的正相关(P<0.01)，蛋白质含量和脂肪含量均与叶绿素变化率存在着极显著的正相关(P<0.01)，说明叶绿素含量的增长会极显著促进蛋白质含量和脂肪含量的增加。滞绿型大豆则可以使叶绿素含量长期维持在较高水平，从而使蛋白质和脂肪含量均显著提高，由此推断，滞绿大豆可以作为培育双高(高蛋白高脂)大豆品种的种质材料。

3 讨 论

近几年对滞绿突变体的鉴定和有关基因的克隆加快了对叶片叶绿素降解的研究，高等植物叶片叶绿素降解的脱镁叶绿酸氧化酶(Pheide a oxygenase，PaO)途径已经阐明[17]。本研究中根据种皮色和子叶色将大豆滞绿突变体后代材料进行分类，主要侧重于从形态和生理水平上观察比较大豆滞绿和诱变后非滞绿大豆的差异及变化规律。通过研究4种类型诱变后代大豆的生育期叶绿素SPAD值的变化情况及叶绿素在衰老期降解幅度大小，发现种皮色和子叶色与叶片衰老期叶绿素降解程度存在着很大的关系。在大豆子叶色一致的情况下，种皮色越绿叶片叶绿素含量的变化率越大，滞绿性越强，反之则滞绿性较弱；种皮色一致(均为浅绿色)的情况下，在大豆衰老期，子叶色为绿色的突变系比黄色的突变系叶片叶绿素含量高，叶绿素降解幅度大，滞绿性强。因此按照种皮和子叶都滞绿与仅种皮滞绿可以划分为2种大豆种子的滞绿基本类型[18]。Spano等[19]研究发现硬粒小麦功能性滞绿突变家系‘139’、‘142’、‘196’和‘504’相对于野生型，叶片叶绿素降解速率减缓，本研究中滞绿大豆相对于黄色大豆叶片叶绿素降解程度与Spano等[19]的研究结果一致。Christopher等[20]研究证实，滞绿小麦品种‘Seri M82’在灌浆期绿叶面积持续时间较长，叶绿素降解缓慢。植物滞绿突变体叶绿素降解机理已在分子基因水平上得以研究[2]，本研究的结果在生理水平上验证滞绿突变体叶绿素降解的变化情况。

表3 蛋白含量、脂肪含量与叶绿素的相关性Table 3 Correlation between protein content, fat content and chlorophyll

滞绿大豆在逆境胁迫或衰老的情况下，由于自身叶绿素无法降解，可以延长抗逆或者衰老的时间，保证正常的光合作用进行，以此提高产量或品质。黄瑞冬[21]在对干旱胁迫下滞绿作物的生理状况研究时发现，滞绿作物的叶片除叶绿素降解慢还保持着较强的光合作用。陈骏伯[3]发现持绿小麦在灌浆后期叶片中的活性氧清除系统可以持续高效地清除活性氧(ROS)和H2O2，从而使其在衰老时期依旧能够维持较高的光合速率，使同化物大量积累，从而使产量增加。本研究由于试验条件的限制和材料数量较多，只测定大豆鼓粒期的光合指标。作为决定豆科作物产量高低的关键时期[22]，鼓粒期会进行大豆生育期各阶段最多的籽粒干物质积累，且干物质积累的状况直接影响后期大豆产量的形成[23]。按照种皮和子叶色划分的类群归类整理统计，对各类群大豆鼓粒期的光合指标情况进行测定分析。结果发现，无论子叶或者种皮颜色如何，光合作用的强度并未由此造成直观的改变，但综合品质指标的情况发现，滞绿突变体类群的品质指标均优于黄色种皮黄色子叶的类群，这说明滞绿突变体类群的光合作用比普通大豆突变体类群持续更久，会产生更多的有机物积累，以此达到高产优质的特性。

60Co-γ诱变育种的重要目的是改善大豆品质[24]。Hörtensteiner[25]研究表明，光系统反应中心的叶绿素结合蛋白对氮源的高效再利用在植株的生长发育过程中起到重要作用。本研究中发现，无论滞绿与否，大豆叶片中叶绿素的含量与大豆蛋白质含量呈极显著正相关关系(P<0.01)，与Hörtensteiner[25]研究结果一致。任钧等[20]在已有研究基础上推测大豆发育与成熟阶段需要从衰老的叶片中导入大量的氮素, 因此滞绿性状虽然可以影响衰老叶片中蛋白降解与转运，但是对产量和品质性状的改良是不利的，本研究中类群Ⅰ的滞绿性状与类群Ⅱ相比更加明显，若按照滞绿性状可以使植物进行更多有机物积累的推测，类群Ⅰ的蛋白质含量应该显著高于类群Ⅱ，但是实际结果恰恰相反，印证了任钧等[20]的推测。王玫等[26]的研究中发现蛋白质含量的稳定性与产量、脂肪含量呈较强的负相关；李志刚等[27]在对大豆籽粒中干物质、脂肪和蛋白质积累规律的研究中发现，在大豆籽粒形成前期，蛋白质积累量与脂肪积累量呈显著正相关，但从中期开始，脂肪积累量便随着蛋白质积累量增加开始出现减少的情况。因此籽粒形成过程中蛋白质和脂肪含量同时增高的情况并不常见，而本研究中的蛋白质含量、脂肪含量与叶绿素含量变化率均呈现显著的正相关，虽然脂肪含量的增长状况并未表现十分明显，其中存在的机理也有待进一步试验探讨。