史亚敏，裴京霞，许幼发,3，顾永卫,3，武 鑫,3,陈建明,3*

(1.福建中医药大学药学院药剂学教研室，福州 350108；2.东部战区空军医院药剂科，南京 210002；3.上海维洱实验室，上海 201712)

多西他赛是紫杉醇家族的一种强效抗癌药物，通过促进微管蛋白聚合和抑制微管解聚，形成稳定的非功能性微管束，从而发挥抗肿瘤作用[1]。多西他赛已被广泛用于治疗多种晚期和转移性肿瘤，包括非小细胞肺癌和晚期胃癌等。与大多数化疗药物一样，上市制剂多西他赛注射液(商品名 Taxotere)以吐温80作为增溶剂，静脉注射后易造成严重的中性粒细胞减少、白细胞减少、神经毒性、脱发、乏力等多种不良反应[2]。目前对市售多西他赛注射液的改造主要集中在前药与新剂型上。前药方面的研究主要有多西他赛-维生素E前药[3]、在多西他赛7-OH位进行修饰的糖基化多西他赛前药[4]以及在2′-OH位进行修饰的弱碱性多西他赛前药[5]等。剂型方面的研究主要有多西他赛纳米粒[6]、多西他赛泡囊[7]等。

棕榈酸是一种脂肪酸，能作为能量物质被癌细胞大量摄取，因此多用于脂溶性前药的合成[8]。本研究将多西他赛制成多西他赛棕榈酸酯(docetaxel palmitate,DTX-PA)前药，可以改善多西他赛脂溶性差、毒副作用大的问题。脂质体是一种纳米载体，在延长体内循环时间、提高稳定性、增加药物溶解度以及降低毒性等方面表现出良好的应用前景，成为了目前药物新剂型研究的热点[9]。现阶段针对多西他赛脂质体的研究有很多，但均因包封率<80%而存在给药剂量大、药效差等问题[6,10]。本研究结合前药和脂质体的优势，制备成多西他赛棕榈酸酯脂质体(docetaxel palmitate liposome,DTX-PA-L)，可以显著提高药物的脂溶性，从而提高制剂成药性，达到增效减毒的效果。

1 材 料

1.1 仪器 Centrifuge 5418离心机(德国艾本德公司)；BS124S电子分析天平(德国Sartorius 公司)；ADVIA2120i全自动血球分析仪(德国Siemens公司)；R-205旋转蒸发仪(瑞士Buchi公司)；NANO-ZS 90Zetasizer分析仪(英国Malvern公司)；Agilent 1260II高效液相色谱仪(美国Agilent公司)。

1.2 药品和试剂 多西他赛(纯度≥99%，江苏红豆杉药业有限公司)；棕榈酸(纯度>98%，国药集团化学试剂有限公司)；DTX-PA(纯度≥95%，上海维洱实验室自制)；Lipoid EPCS蛋黄磷脂、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(DSPE-PEG2000，上海利宝德生物技术有限公司)；无水硫酸钠(纯度>99.0%)和柠檬酸(纯度>99.5%)由上海泰坦科技有限公司提供；多西他赛注射液(商品名 Taxotere，赛诺菲制药有限公司)；甲醇为色谱纯；二氯甲烷、4-二甲氨基吡啶(DMAP)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)等试剂均为分析纯。

1.3 细胞和动物 小鼠S180细胞株(中国科学院上海生命科学研究院)；雄性ICR小鼠，体质量18～20 g(上海斯莱克实验动物有限公司)，实验动物许可证号:SCXK(苏)2018-0006。

2 方法和结果

2.1 DTX-PA的合成及鉴定 精密称取1.06 g(1.24 mmol)多西他赛，适量EDC和DMAP、3.81 g(14.86 mmol)棕榈酸，置于50 ml的茄型瓶中，加入适量无水二氯甲烷溶解，搅拌反应30 min，N2保护下反应过夜。用薄层色谱法(TLC)点板监测反应至结束，将反应液分别用饱和柠檬酸、食盐水洗至中性，用无水硫酸钠干燥过夜。采用柱层析干法上样法对目标产物进行分离纯化，最终得到白色粉末状固体DTX-PA。DTX-PA的合成路线如图1所示。

取适量DTX-PA样品，采用ESI-MS、1H-NMR和13C-NMR对其结构进行确认。(1)质谱结果ESI-MS(m/z):1 046.6[M+H]+，1 068.60[M+Na]+(见图2)。(2)氢谱结果1H-NMR(600 MHz,DMSO-d6):δ 7.97[d,J=7.89 Hz,2H,OBz(o)]；7.81[d,J=9.20 Hz,1H,H-N(3′)]；7.70[t,J=7.36 Hz,1H,OBz(p)]；7.62[t,J=7.62 Hz,2H,OBz(m)]；7.38[t,J=7.62 Hz,2H,3′-Ph(m)]；7.35[d,J=7.62 Hz,2H,3′-Ph(o)]；7.15[t,J=7.29 Hz,1H,3′-Ph(p)]；5.75[t,J=8.90 Hz,1H,H-C(3′)]；5.07[m,2H,H-O(10),H-O(7)]；4.97[d,J=7.30 Hz,1H,H-C(13)]；4.88[brs,1H,H-O(1)]；4.87[d,J=2.92 Hz,1H,H-C(2′)]；4.39[s,1H,H-C(10)]；3.98～4.06[m,3H,H-C(20α,20β),H-C(5)]；3.62[d,J=7.13 Hz,1H,H-C(3)]；2.32～2.36[m,2H,H-C(2″)]；2.25～2.27[m,1H,H-C(6α)]；2.22[s,3H,H-C(OAc)]；1.78～1.84[m,1H,H-C(6β)]；1.67[s,3H,H-C(18)]；1.49[s,3H,H-C(19)]；1.35[s,9H,H-C(t-Bu)]；1.22～1.28[m，26H,H-C(CH2×13)]；0.96[s,6H,H-C(16,17)]；0.83[t,J=7.81 Hz,3H,H-C(16″)]。(3)碳谱结果13C-NMR(125 MHz,DMSO-d6):δ 211.22,174.11,171.42,170.92,167.16,157.03,138.75,137.83,135.26,131.94,131.43,130.51,130.39,129.88,129.29,85.64,82.17,80.26,78.69,77.27,76.81,76.68,75.59,73.00,72.60,58.85,57.00,47.83,44.75,38.33,36.59,35.10,33.17,30.92,30.88,30.73,30.58,30.50,30.17,29.99,28.31,26.23,24.36,23.97,22.63,15.81,15.47,11.65。结构鉴定结果表明，本研究成功合成了DTX-PA前药。

2.2 DTX-PA-L的制备 采用薄膜分散法制备DTX-PA-L，精密称取2.5 g磷脂、200 mg DTX-PA、0.21 g DSPE-PEG2000置500 ml圆底烧瓶中,加入适量无水乙醇溶解，55 ℃旋转蒸发除去有机溶剂，在烧瓶内壁形成一层均匀透明的薄膜，加入55 ℃预热的蒸馏水振荡、水化得到DTX-PA-L制剂粗品。将得到的粗品用0.22 μm微孔滤膜过滤，即得到成品DTX-PA-L。

2.3 DTX-PA-L的表征

2.3.1 粒径和电位的测定 取适量DTX-PA-L，用去离子水按1∶20的比例稀释，采用NANO-ZS 90Zetasizer分析仪对其粒径和电位进行测定。结果显示3批DTX-PA-L均为单峰，平均粒径为(110.66±0.75) nm，多分散系数(PDI)为0.11±0.01，平均zeta电位为(-30.79±1.51) mV(n=3)。DTX-PA-L的粒径和zeta电位分布图见图3。

2.3.2 包封率的测定 (1)色谱条件 色谱柱：Agilent Zorbax Eclipse Plus C18柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm)； 流动相为甲醇∶水=95∶5； 柱温30 ℃； 流速1.0 ml/min；进样量20 μl； 检测波长230 nm。(2)检测方法 采用超滤离心法对制备的DTX-PA-L的包封率进行测定。精确吸取1 ml脂质体置于超滤管中，以相对离心力2.134×103×g离心15 min，采用HPLC法测定滤液中的药物浓度。另取200 μl DTX-PA-L，置5 ml容量瓶中，用100 μl异丙醇破乳，再用甲醇溶解并定容，进样测定。包封率计算公式如下：EE(%)=[(c总×V总-c水×V水)/(c总×V总)]×100%。式中，c总为1 ml脂质体中药物的总浓度，c水为超滤离心后水相中的药物浓度，V总为脂质体的总体积，V水为水相的体积。测得3份不同批次DTX-PA-L的平均包封率为(95.77±0.35)%。

2.3.3 形态学观察 分别取适量DTX-PA-L溶液滴在喷碳铜网表面，使液体尽量铺满整个铜网，以2%的磷钨酸溶液负染3 min后，在透射电镜下观察其形态。DTX-PA-L的电镜图见图4，由图4可观察到脂质体外观圆滑，多为椭圆形或圆形。

2.3.4 稳定性研究 将3份DTX-PA-L样品放置于4 ℃冰箱，分别在0、2、4、8、12、24 h测定DTX-PA-L的含量、粒径和PDI，考察DTX-PA-L的稳定性，结果见表1。结果表明，在4 ℃条件下，DTX-PA-L可稳定保存24 h。

表1 DTX-PA-L的稳定性实验结果Table 1 Results of stability test of DTX-PA-L

2.4 药效学研究

2.4.1 S180腹水移植瘤小鼠模型的构建 将处于对数生长期的S180细胞注入ICR小鼠腹腔。选取健康状态良好、腹水形态明显的2代腹腔荷瘤小鼠，在无菌条件下抽取腹水，用生理盐水稀释细胞浓度至1×107个/ml，得到S180细胞悬液，并按剂量0.2 ml/只接种于小鼠右侧腋下，选取肿瘤形成明显的小鼠用于实验。

2.4.2 DTX-PA-L的抗肿瘤作用 待肿瘤长到适当体积后，将ICR小鼠称重，并随机分为生理盐水组、阳性对照组和实验组，每组10只。采用尾静脉注射方式给药，生理盐水组给予0.2 ml生理盐水，阳性对照组给予多西他赛注射液(商品名 Taxotere，给药剂量按多西他赛计10 mg/kg)，实验组给予DTX-PA-L(给药剂量按多西他赛计10 mg/kg)，隔天给药一次，共给药4次。停药48 h后，称取小鼠体质量，处死小鼠，剥瘤并称重，计算给药后抑瘤率。抑瘤率=[(mC-mT)/mC]×100%，式中mC表示生理盐水组小鼠的平均瘤重，mT表示给药组小鼠的平均瘤重。生理盐水组、阳性对照组和实验组小鼠的平均瘤重分别为(1.29±0.27)、(0.46±0.04)和(0.26±0.05) g。与生理盐水组相比，多西他赛注射液和DTX-PA-L对S180肉瘤均有抑制作用(P<0.001)，但同等剂量下实验组的抑瘤率达到79.96%，而阳性对照组只有64.15%。结果表明，与市售多西他赛注射液相比，DTX-PA-L能显著提高药物的体内抗肿瘤活性(P<0.001)。

2.5 DTX-PA的初步安全性评价 在体内抗肿瘤实验中，观察各组小鼠的生存情况和生理状态。各组小鼠的存活率为100%，但Taxotere给药后小鼠出现呼吸急促、抽搐等毒副作用。在停药48 h后，取小鼠眼眶血进行血常规检测。以中性粒细胞、白细胞、红细胞、血红蛋白、血小板为评价指标，初步对DTX-PA-L的安全性进行考察。小鼠血常规检测结果见表2，结果表明，与阳性对照组相比，实验组小鼠的中性粒细胞、血小板、白细胞均显著升高(P<0.001)，表明DTX-PA-L的血液毒性低于多西他赛注射液(商品名 Taxotere)。

表2 S180荷瘤小鼠血液指标的比较Table 2 Comparison of hematological parameters of S180 bearing mice

3 讨 论

本研究采用一步酯化法合成了DTX-PA前药，且成功将其包载于脂质体中。与已上市的多西他赛注射液(商品名 Taxotere)相比，DTX-PA-L能显著提高抗肿瘤效果。这可能是由于棕榈酸与多西他赛制备成DTX-PA前药后，增加了DTX的脂溶性，进而能提高制剂的成药性；同时，棕榈酸是一种脂肪酸，可以作为能量物质被癌细胞或癌组织大量摄取，促进肿瘤细胞对其的摄取；此外，以脂质体为载体制备的DTX-PA-L利用肿瘤的高通透性和滞留效应(enhanced permeability and retention effect,EPR)，更多地聚集于肿瘤内，在肿瘤组织酯酶的作用下，前药缓慢代谢出母药，达到靶向肿瘤、增强疗效的目的[11]。多西他赛毒性较大，制备成前药包载于脂质体后，可显著降低其血液毒性，这可能是由于制备成DTX-PA-L后，DTX-PA在血液中会缓慢释放出多西他赛，血液中多西他赛的累积量减少，从而降低了多西他赛的生物毒性[12]。本研究制备的DTX-PA-L纳米给药系统在降低毒性和提高抗肿瘤效果上具有独特的优势，为多西他赛新制剂的研制提供了一种新的研究思路。