王晓薇，樊 毅，马小明，马丽娜，岳彩娟，王 锦，赵正伟，马 青，*

(1.宁夏农林科学院 动物科学研究所，宁夏 银川 750000； 2.银川中科元昊科技有限公司，宁夏 银川 750000)

滩羊是我国珍稀的肉裘兼用地方绵羊良种，主要分布在宁夏，辐射甘肃、陕西、内蒙等狭窄生态区的干旱半荒漠地区[1]，其肉质细嫩鲜美、无膻腥味，所产的二毛裘皮是宁夏特产毛皮，因毛穗柔软洁白、轻暖美观，在国内外享有盛誉。毛色是动物品种的重要表型特征之一，是滩羊重要的经济性状。滩羊体躯多为白色，头部以黑、黄、褐斑为主，少数纯白，极少纯黑色等[1]，较之杂色，纯白色更受消费者的青睐。研究表明，与动物毛色相关的基因和位点多达378个[2]，这些基因功能多是调控黑色素的生成。黑色素皮质受体-1基因(MC1R)是控制毛色的重要候选基因之一，近年来国内外学者对MC1R基因研究较多，但大多关注基因多态性与毛色表型的研究，对该基因表达量与毛色表型的研究较少，有关滩羊MC1R基因的研究更是鲜有报道。

为了探究影响哺乳动物毛色的MC1R基因和TCF25基因与滩羊毛色的关系，培育更加具有裘皮商业价值的滩羊，提高宁夏滩羊裘皮的市场竞争力，前期已经开展了对滩羊毛色候选基因筛选的研究。基于不同毛色滩羊(白色、褐斑、黑斑)群体的SNP 600K芯片分型数据，借助遗传分化系数FST法进行群体间选择信号检测分析，应用生物信息学方法分析筛选到与滩羊毛色形成相关的候选基因MC1R和TCF25。本研究采用qRT-PCR技术对滩羊MC1R基因和TCF25基因mRNA在不同毛色滩羊(纯白、褐斑、黑斑)皮肤组织中的表达量进行检测，以验证目的基因与滩羊毛色的关系，旨在为滩羊毛色形成机制提供相关理论，为滩羊毛色选育与品种改良提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验动物和材料

1.1.1 试验动物

本试验所用的15只滩羊均来自宁夏盐池滩羊场的纯种滩羊。根据毛色的不同将滩羊分为3组，每组选取5只，分别是全身白毛(简称全白)，身体全白、头部黑色或带部分黑色斑点(简称黑斑)，身体全白、头部带褐色或黄色斑点(简称褐斑)。用取皮器在头部带色部位取皮肤组织2 cm2，迅速装入无酶冻存管并放入液氮罐中，带回实验室于-80 ℃冰箱保存。

1.1.2 引物设计与合成

依据NCBI基因库公布的绵羊MC1R(登录号：DQ530057.1)和TCF25(登录号：XM_027977786.1)以及GADPH(登录号：HM043737.1)的基因序列，用Primer Premier 5.0软件为目的基因(MC1R、TCF25)和内参基因(GADPH)各设计一对引物，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物序列见表1。

1.2 试剂与仪器

1.2.1 主要试剂

Trizol(TaKaRa公司)，RT-PCR试剂盒(VAZYME公司)，DEPC(美国Sigma公司)，RNasin(美国Promega公司)，反转录试剂盒(YEASEN公司)等。

1.2.2 主要仪器

表1 滩羊MC1R、TCF25、GADPH基因引物序列

超速冷冻离心机、NanoPhotometer-N60(IMPLEN，德国)，Real-time PCR扩增仪(Bio-Rad，美国)，水平电泳槽(Bio-Rad，美国)，凝胶成像系统(Bio-Rad，美国)。

1.3 试验方法

1.3.1 不同毛色滩羊皮肤组织总RNA的提取与cDNA的合成

取液氮保存的皮肤组织约100 mg用Trizol法提取总RNA。分别吸取1 μL总RNA溶液，使用NanoPhotometer-N60超微量分光光度计测定D260/D280、D260/D230，将所提取的总RNA用1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量。将测定好的总RNA溶液分别稀释定量至50 ng·μL-1，迅速分装并置于超低温冰箱中(-80 ℃)保存。参照YEASEN反转录试剂盒(Hifair®Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit RNA PCR Kit)说明书，对所提取的总RNA进行反转录，合成cDNA第一链，-20 ℃冰箱中保存备用。

1.3.2 实时荧光定量PCR反应

本研究采用Bio-Rad Themal Cycler荧光定量PCR仪(C-1000 Touch)进行荧光定量PCR实验，扩增反应总体系为20 μL，其中Q711 2×ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 10.0 μL，PCR Forward Primer(10.0 μmol·L-1)1.0 μL，PCR Reverse Primer(10.0 μmol·L-1)1.0 μL，cDNA模板1.0 μL，ddH2O 7.0 μL。扩增程序：预变性95 ℃ 3 min；变性95 ℃ 10 s，退火58.7 ℃ 30 s，39个循环；熔解曲线95 ℃ 10 s，65 ℃ 5 s，95 ℃ 15 s，每个样重复3次。在收集荧光信号的过程中，通过熔解曲线分析引物扩增的特异性。

1.4 数据处理

目的基因相对表达水平采用2-ΔΔCt方法计算，其中ΔCt=Ct目的基因-Ct内参基因，ΔΔCt=ΔCt-对照组ΔCt的平均值，表达量以平均值±标准差表示。数据经过Microsoft Excel整理后利用SAS8.2进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 总RNA提取结果分析

提取的总RNA通过NanoPhotometer-N60超微量分光光度计检测，结果显示，RNA浓度在200～600 ng·μL-1，D260/D280均在1.8～2.0，D260/D230值大于2.0，说明所提取的RNA浓度、纯度较高。此外，提取的总RNA利用1%琼脂糖凝胶电泳进行检测，结果如图1所示，RNA的3条带清晰可见，分别为28S、18S、5S，无明显降解，说明提取的RNA样品完整、质量较好、浓度高且无污染，符合要求，可进行后续试验。

2.2 不同毛色滩羊MC1R基因在皮肤组织表达差异

本研究采集的滩羊皮肤组织均来自饲养方式相同的同一养殖场内，通过实时荧光定量PCR反应，都以GADPH作为内参基因。MC1R基因在不同组织中的表达量如图2所示，可见MC1R基因在3种不同毛色滩羊皮肤组织中均有表达，表达量由大到小依次为黑斑>褐斑>全白。MC1R基因在黑斑滩羊皮肤组织中的表达量极显著高于于纯白色滩羊(P<0.01)，显著高于褐斑滩羊(P<0.05)，褐斑滩羊皮肤组织中的表达量与纯白滩羊皮肤组织表达量相比差异不显著(P>0.05)。MC1R基因在黑斑滩羊皮肤组织中的表达量最高，为22.32±4.67；其次是褐斑滩羊，为9.69±2.27；最低的是纯白色滩羊，为7.14±1.45。

图1 总RNA琼脂糖凝胶电泳检测结果Fig.1 The results of agarose gel electrophoresis of total RNA

*和**分别表示差异达显著(P<0.05)或极显著水平(P<0.01)。* and ** indicated significant differences at the level of 0.05 and 0.01， respectively.图2 MC1R mRNA在不同毛色滩羊皮肤组织中的定量表达Fig.2 The expression level of MC1R mRNA in skin of Tan sheep with different coat color

2.3 不同毛色滩羊TCF25基因在皮肤组织表达差异

TCF25基因在不同组织中的表达量如图3所示，TCF25基因在3种不同毛色滩羊皮肤组织中均有表达，其中表达量最高的纯白色滩羊组，表达量为1.68±0.47；其次为褐斑组，表达量为1.32±0.21；最低的是黑斑组，表达量为0.99±0.15。3组间差异均不显著(P>0.05)。

图3 TCF25 mRNA在不同毛色滩羊皮肤组织中的定量表达Fig.3 The expression level of TCF25 mRNA in skin of Tan sheep with different coat color

3 讨论

MC1R基因是G蛋白耦合受体—黑色素皮质激素受体家族成员之一，在机体中有多种效用，可与α-促黑素(α-melanocyte stimulating hormone， α-MSH)、肾上腺皮质激素(adreno cortico hormones，ACTH)结合，使细胞膜上的腺苷酸环化酶活化，三磷酸腺苷(ATP)转化为环腺苷酸(cAMP)，cAMP激活酪氨酸激酶，酪氨酸激酶激活酪氨酸，进而影响真黑素和褐黑素的产生。当黑色素细胞中活化的酪氨酸过量，细胞合成真黑素；当活化的酪氨酸含量较少，细胞合成褐黑素[3-6]。

有研究报道，哺乳动物MC1R基因主要在毛囊和皮肤黑色素细胞中表达[7]。王乐等[8]在哺乳动物中研究发现，MC1R基因表达量在毛囊和皮肤黑色素细胞中最高，与毛色和肤色色素沉积密切相关。MC1R基因的高表达有利于黑色素细胞中真黑素的形成，细胞中真黑素的含量较高就会使动物表现黑或褐的毛色表型[9]。高泽成[10]对MC1R基因在不同颜色牦牛皮肤组织中的表达量进行研究，结果显示，MC1R基因在纯黑色大通牦牛皮肤组织中的表达量极显著高于纯白色天祝白牦牛，是天祝白牦牛的2.4倍(P<0.01)。任玉红等[11]利用RT-PCR技术在对不同毛色羊驼个体皮肤组织中MC1R基因的表达量研究中发现棕色被毛个体该基因表达量是白色被毛的4.32倍，差异极显著(P<0.01)。景炅婕等[12]对MC1R基因在不同毛色(纯黑、纯白、黄褐和黑斑白)太行山羊皮肤中表达量进行比较的研究中发现：MC1R基因在纯黑个体中表达量最高，在黄褐色个体中表达量次之，纯白色较低。大量的研究证明，MC1R基因与羊的毛色性状有关，本研究结果显示，MC1R基因在黑斑滩羊皮肤组织中的表达量最高(22.32±4.67)，极显著高于纯白色滩羊(P<0.01)，显著高于褐斑滩羊(P<0.05)，这与MC1R基因高表达会使动物产生深色毛发的结果相一致，与高泽成[10]、任玉红等[11]、景炅婕等[12]在不同毛色动物皮肤组织中MC1R基因mRNA表达量深色大于浅色的研究结果相符。同时也证明了MC1R基因与宁夏盐池滩羊的毛色性状相关。

TCF25基因是胚胎发育中十分重要的转录因子[13]，属于基本—螺旋—环—螺旋(bHLH)结构。近年来有关TCF25基因的研究不多，几乎都集中在医学领域，与毛色相关的报道就更为鲜见。Li等[14]利用随机森林法在对42只绵羊(18只黑色，24只白色)进行GWAS分析，发现有86%的黑色羊在位点s26449处发生碱基突变，而此位点距离TCF25基因419 bp，这表明TCF25基因与毛色存在潜在关联。Kim等[15]对3种韩牛群体(济州黑牛、斑纹韩牛、棕色韩牛)进行基因组选择信号检测，利用群体分化分析(FST法)检测斑纹牛基因组中的受选择区域，定位候选基因MC1R和TCF25。Hysi等[16-17]在人类发色研究中，对数万个欧洲人的几类头发颜色(金色、红色、浅棕、深棕、黑色)进行全基因组关联分析，定位到多个影响发色的候选基因中就包括TCF25基因。本研究发现，TCF25基因在不同毛色滩羊皮肤组织中均有表达，但表达量差异不显著。可能是由于样本含量较小和统计分析误差所致。其中，纯白色滩羊皮肤组织中表达量最高，褐斑组次之，在黑斑皮肤组织中表达量较低。

4 结论

试验表明，MC1R与TCF25基因在滩羊不同毛色皮肤组织中均有表达，且MC1R基因的mRNA表达量组间具有显著性差异，其中头部黑斑个体表达量最高，褐斑滩羊次之，纯白色滩羊最低，TCF25基因mRNA表达量在3组毛色滩羊之间有差异但差异不显著(P>0.05)。这验证了目的基因与滩羊毛色间的关系，证实了MC1R基因表达量对黑色素颗粒的形成起着重要的调控作用，其高表达有利于真黑素形成进而使细胞中黑色素含量增高，表现出黑色或深色毛色的结论[9-10]，为今后滩羊毛色选育与品种改良提供参考。