王 扬， 铁 偲， 刘 霜， 陈 煜， 段钟平， 郑素军， 张金兰

1 首都医科大学附属北京佑安医院 疑难肝病与人工肝中心， 北京 100069 2 协和医科大学中国医学科学院 药物研究所， 北京 100050

病毒性肝炎是全球性的公共卫生问题，其中HBV和HCV在亚洲地区是肝硬化和肝癌的重要病因[1]。越来越多的证据[2-5]表明，鞘脂代谢物在病毒性肝炎、肝硬化及肝细胞癌等诸多肝脏相关疾病中有独特的代谢物表达谱，并参与疾病的病理生理过程，其中可能蕴含着此类疾病的新型治疗策略。在本研究中，拟探索病毒性肝炎肝硬化与非病毒性肝硬化患者外周血清鞘脂表达谱的不同。

1 资料与方法

1.1 研究对象 选取2014年7月-2015年5月首都医科大学附属北京佑安医院疑难肝病及人工肝中心收治的104例肝硬化患者为研究对象，其中病毒性肝炎肝硬化66例，非病毒性肝硬化患者31例，另病因未明肝硬化患者7例未纳入本研究。

入选标准：影像学、生化或血液学检查有肝细胞合成功能障碍或门静脉高压症(如脾功能亢进及食管胃底静脉曲张)证据，或组织学符合肝硬化诊断(例如Metavir评分=4或Ishak纤维化评分≥5)，或FibroScan检测结果>17.5 kPa。排除标准：经影像学或肝穿刺病理检查诊断为肝癌患者；合并严重的其他疾病，包括未被控制的原发性肾脏、心脏、肺脏、血管性、神经性、消化性、代谢性疾病(明显甲状腺功能亢进、严重糖尿病和肾上腺疾病)；脂质代谢异常，如严重高脂血症、脂质贮积病、肥胖症(BMI≥30 kg/m2)、免疫缺陷病或合并其他系统肿瘤等；妊娠或哺乳期。

1.2 血液生化指标及血清鞘脂检测 肝功能、生化等检测由首都医科大学附属北京佑安医院检验中心完成，使用自动生化检测器(AU640生化分析仪，OLYMPUS，日本)进行ALT和AST等生化指标的测定。血清AFP检测使用自动电化学发光免疫分析法(罗氏诊断,上海)。血清鞘脂的检测由中国医学科学院药物研究所完成，采用高效液相色谱与串联质谱法，Agilent 6410B Triple Quad质谱仪购自安捷伦科技有限公司，其中包含了配备Agilent 1200 RRLC系统的三级四级质谱仪(Agilent Technologies Inc., Santa Clara, 美国)。共检测57种鞘脂的表达，包括12种神经酰胺(Ceramide)、5种二氢神经酰胺(dihydroCeramide)、16种神经酰胺-1-磷酸(Ceramide-1-phosphate)、14种糖化神经酰胺(Hexosylceramide)、1种二氢鞘氨醇(dihydroSphingosine)、1种二氢鞘氨醇-1-磷酸(dihydroSphingosine-1-phosphate)、5种二氢神经酰胺-1-磷酸(dihydroCeramide-1-phosphate)、1种鞘氨醇(Sphingosine)、1种鞘氨醇-1-磷酸(Sphingosine-1-phosphate)及1种糖化鞘氨醇(HexSphingosine)。

1.3 伦理学审查 本研究获得首都医科大学附属北京佑安医院医学伦理审查委员会批准(批号：京佑科伦字[2017]14号)。

2 结果

2.1 两组患者一般资料比较 纳入此项分析的97例患者中，男71例，女26例，平均(54.44±11.48)岁。66例病毒性肝炎肝硬化患者中，乙型肝炎肝硬化49例，丙型肝炎肝硬化15例，HBV重叠HCV所致肝硬化患者2例；31例非病毒性肝硬化患者中，酒精性肝硬化患者17例，原发性胆汁性肝硬化8例，药物性肝硬化6例。

病毒性肝炎肝硬化患者与非病毒性肝硬化患者的年龄、男性比例、TBil、DBil及GGT等临床指标之间差异均无统计学意义(P值均>0.05)(表1)。

表1 两组患者的临床特征比较

2.2 两组患者外周血清鞘脂表达水平 57种鞘脂中，3种鞘脂表达水平差异均有统计学意义(P值均<0.05)，分别为Cer(d18∶1/12∶0)、HexCer(d18∶1/14∶1)和dhCer(d18∶0/2∶1)-1-P；其余鞘脂表达水平在两组中差异均无统计学意义(P值均>0.05)(表2)。

表2 两组患者的外周血清鞘脂表达水平比较

2.3 logistic多因素回归分析 将两组表达水平有统计学差异的结果纳入logistic多因素回归分析，结果表明，dhCer(d18∶0/24∶1)-1-P水平高表达与病毒性肝炎肝硬化独立相关(比值比=1.11, 95%可信区间：1.004～1.225,P=0.042)。

2.4 57种鞘脂在病毒性肝炎肝硬化中的亚组分析 对66例病毒性肝炎肝硬化患者进一步进行亚组分析，结果表明，Cer(d18∶1/12∶0)、HexCer (d18∶1/14∶1)和dhCer(d18∶0/24∶1)-1-P在乙型肝炎肝硬化和丙型肝炎肝硬化患者之间的表达水平差异均无统计学意义[Cer(d18∶1/12∶0)：(168.85±0.67) pmol/0.1 ml vs (168.88±0.69) pmol/0.1 ml,Z=-0.563,P=0.574；HexCer (d18∶1/14∶1)：(217.42±10.71) pmol/0.1 ml vs (213.65±3.20) pmol/0.1 ml,Z=-0.610,P=0.542；dhCer(d18∶0/24∶1)-1-P：(60.71±2.28) pmol/0.1 ml vs (60.67±2.07) pmol/0.1 ml,Z=-0.579,P=0.563]。其余54种鞘脂表达中，Cer(d18∶1/18∶0)、dhCer(d18∶0/18∶0)、dhCer (d18∶0/18∶1)和dhCer(d18∶0/16∶1)-1-P在乙型肝炎肝硬化和丙型肝炎肝硬化患者之间的表达水平差异均有统计学意义[140.69(77.19～215.90) pmol/0.1 ml vs 81.03(47.88～155.51) pmol/0.1 ml，Z=-2.084，P=0.037；60.62(59.89～61.44) pmol/0.1 ml vs 59.64(59.44～60.71) pmol/0.1 ml ，Z=-2.354，P=0.019；62.43(60.31～67.22) pmol/0.1 ml vs 60.77(59.84～62.12) pmol/0.1 ml ，Z=-2.171，P=0.030；131.06(107.76～184.42) pmol/0.1 ml vs 110.48(90.19～117.59) pmol/0.1 ml，Z=-2.829，P=0.005]。

3 讨论

在亚太地区，病毒性肝炎是导致肝硬化、肝癌最重要的原因。虽然有部分研究报道了三类人群具有独特的鞘脂代谢产物表达谱，可以作为辅助诊断的分子标志物[6-7]，但是病毒性肝炎肝硬化患者与非病毒性肝硬化患者的鞘脂代谢产物表达谱有何不同，目前尚未有研究报道，加强该方面研究有助于从鞘脂代谢角度阐明其发病机制、寻找新的治疗靶标。本研究采用高效液相色谱-质谱分析方法，检测病毒性肝炎肝硬化患者血清中57种鞘脂表达水平，首次发现dhCer(d18∶0/24∶1)-1-P与病毒性肝炎肝硬化密切相关。

虽然临床实践中用同样的实验室及生化检查评估肝脏的损伤程度，但是病毒性肝炎肝硬化患者有自己独特的临床及病理特征。有研究[8]表明，与酒精性肝硬化患者容易发生凝血功能障碍和心肌病相比，病毒性肝炎肝硬化患者更易发生肝性脑病和心血管。同时有研究[9-11]表明，HBV或HCV感染者中，固有免疫细胞Toll样受体可能参与机体抗病毒的过程，其表达下调，并伴随病毒发生免疫逃逸。

二氢神经酰胺及糖化神经酰胺是神经酰胺从头合成的中间产物，广泛参与机体凋亡、诱导自噬及引起细胞周期阻滞等。本团队[12-13]既往研究结果提示，二氢神经酰胺可能参与了肝脏疾病慢性化的过程，高表达的二氢神经酰胺(d18∶0/24∶0)可能与HBV相关慢加急性肝衰竭相关，而高表达的糖化神经酰胺可能与病毒复制相关，并且可能成为潜在的诊断生物学标志物。本研究结果与既往结果类似，检测结果中大部分鞘脂表达水平在病毒性肝炎肝硬化中高于非病毒性肝硬化患者。磷酸化的二氢神经酰胺(PDHC)衍生于二氢神经酰胺，广泛存在于血液循环、神经系统及脏器组织中，可能与机体固有免疫应答相关[14]。Nichols等[15-17]研究表明，PDHC能够增强自身免疫应答，增加树突状细胞IL-6的释放，并且与脂多糖表达无关，进一步推测PDHC可能通过作用于Toll样受体2的配体而发挥作用。本研究的结果可能与此类似，dhCer(d18∶0/24∶1)-1-P高表达与病毒性肝炎肝硬化密切相关，但在HBV、HCV等不同病因肝炎肝硬化亚组分析中差异无统计学意义，表明其参与了病毒性肝炎的共同发病过程，可能病毒感染后诱发了机体固有免疫反应，但其具体的调节机制尚有待于进一步的研究。

综上所述，本研究发现血清dhCer(d18∶0/24∶1)-1-P水平上调与病毒性肝硬化密切相关，可能有助于从鞘脂角度深入理解病毒性肝硬化的疾病特征。