张成路，孙越冬，王 静，何 钰，张彦鹏，张 璐，宋府璐

（1.辽宁师范大学化学化工学院,大连116029；2.中钢集团鞍山热能研究院有限公司,煤焦油系新型材料制备技术国家地方联合工程中心,鞍山 114044）

随着对环境的重现，能够简单且有效地检测金属离子备受关注.用于检测金属离子的荧光化学传感器已成为研究的热点［1～3］.已有研究表明，当金属离子与含荧光团分子配位时，会影响和改变其光学物理性能［4］，产生荧光猝灭.由于金属离子作为荧光猝灭剂的选择性不高［5］，对可特异性识别检测金属离子荧光探针的需求随之不断增加.因此，开发能特异性检测金属离子的荧光探针在生物学和环境等领域中具有重要意义.

Hg2+是高细胞毒性和腐蚀性的致癌物［6］.Hg2+在环境和生物体内会导致一系列健康问题,是最具危险性的环境污染物之一.Hg2+在环境中有微生物的存在下会转化为甲基汞,可通过食物链在在人体内积累,其具有的神经毒性会对大脑造成永久性不可逆的急性或慢性毒性损害[7～9].Hg2+很容易穿过生物膜,可能导致大脑、肾脏、中枢神经系统、免疫系统和内分泌系统的损害[10,11].由于Hg2+的高毒性,美国环境保护署（US EPA）已将2 μg/L作为饮用水中Hg2+的最大浓度[12].因此，高选择性荧光检测Hg2+对评估水域或食物供应的安全性至关重要［13～16］.传统的Hg2+检测方法有原子荧光光谱法、原子吸收光谱法和电感耦合等离子体-原子发射光谱法等［17］.荧光探针因具有操作简单方便及样品易制备等优点而成为环境保护和细胞生物学中的有力检测工具.

喹啉酮作为一种类香豆素结构的荧光团，其衍生物用作荧光化学传感器在医学和环境研究中具有潜在用途［18～21］.近年来，关于Hg2+荧光检测的报道中多数探针只能在近中性溶液中检测Hg2+，荧光团主要有罗丹明、1，8-萘酰亚胺和香豆素等［17，22，23］.目前，以具有优良荧光性能的喹啉酮为荧光团，在较大pH范围保持稳定的探针鲜见报道.尤其是有针对性地依据Hg2+易与杂原子配位的特征，在喹啉酮荧光团组块的7号反应位点引入酰基，利用其中的氧原子与汞离子配位，在7号位一端通过碳碳双键与缺电子1，2，4-三唑［3，4-b］-1，3，4-噻二唑芳香杂环结合，设计具有较高量子产率的新型结构探针的研究尚未见报道.

本文将喹啉酮7号位的氨基与马来酸酐进行酰化反应，利用酰基氧原子与Hg2+配位，再通过共轭双键拼合1，2，4-三唑［3，4-b］-1，3，4-噻二唑组块，期望借助其缺电子的特征在较大的共轭体系中影响电子的迁移，同时利用其杂原子与Hg2+配位，从而提高荧光猝灭效果，达到高选择灵敏检测Hg2+的目的，以开发新型Hg2+荧光化学传感器［24］.

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

间苯二胺、乙酰乙酸乙酯和各种金属盐均购于阿拉丁化学试剂公司；甲苯、对甲苯磺酸、冰乙酸、顺丁烯二酸酐、甲醇、乙醇、浓硫酸、水合肼、二硫化碳、氢氧化钾和氢氧化钠均购于天津市科密欧化学试剂有限公司；二氯甲烷、三氯氧磷和苯甲酸均购于国药集团化学试剂有限公司，所用试剂均为分析纯.

Bruker Avance-500 MHz 型核磁共振波谱仪（1H NMR，瑞士Bruker 公司）；F-7000型荧光光谱仪（日本日立公司）；Agilent 6224型高分辨质谱仪（HRMS，美国Agilent公司）；TENSOR 27型傅里叶变换红外光谱仪（FTIR，德国Bruker公司）；WFH-203B型三用紫外分析仪（上海精科实业有限公司）；X-5型数字显微熔点测定仪（北京泰克仪器有限公司）.

1.2 实验过程

荧光探针分子（E）-N-（4-甲基-2-氧代-1，2-二氢喹啉-7-基）-3-（3-苯基-［1，2，4］三唑［3，4-b］［1，3，4］噻二唑-6-基）丙烯酰胺（MNT）的合成路线如Scheme 1所示.

Scheme 1 Synthesis of target compound MNT

1.2.1 中间体7-氨基-4-甲基喹啉-2（1H）-酮（MQ1）和（E）-4-［（4-甲基-2-氧代-1，2-二氢喹啉-7-基）氨基］-4-氧代丁-2-烯酸（MQ2）的合成 参照文献［25］方法合成中间体MQ1 和MQ2，产物均为淡黄色固体.MQ1，收率74.8%，m.p.279.4～280.2 ℃（文献值［25］：276～279 ℃）.MQ2，收率65.4%，m.p.232.7～233.5 ℃.1H NMR（500 MHz，DMSO-d6），δ：12.85（s，1H，COOH），11.54（s，1H，ArNH），10.57（s，1H，NH），7.84（d，J=1.90 Hz，1H，CH），7.65（d，J=8.70 Hz，1H，PhH），7.33（m，1H，CH），6.49（d，J=7.55 Hz，1H，PhH），6.34（d，J=7.00 Hz，1H，PhH），6.27（s，1H，ArH），2.37（s，3H，CH3）.

1.2.2 中间体4-氨基-5-苯基-4H-1,2,4-三唑-3-硫醇(AT)的合成 参照文献［26］方法合成中间体AT.

1.2.3 探针MNT的合成 将0.096 g（0.5 mmol）中间体AT置于100 mL三口瓶中，加入10 mL三氯氧磷后升温至90 ℃，待固体完全溶解后，加入0.163 g（0.6 mmol）中间体MQ2，升温至135 ℃，用薄层色谱监测至反应完全.反应体系冷却至室温后，倒入冰水中搅拌，用稀NaOH溶液调节pH为6～7，过滤，用乙酸乙酯洗涤，经干燥得棕黄色固体MNT，收率67.9%，m.p.＞300 ℃.1H NMR（500 MHz，DMSO-d6），δ：11.51（s，1H，ArNH），10.52（s，1H，NH），7.80（d，J=8.85 Hz，2H，PhH），7.65（d，J=8.75 Hz，1H，PhH），7.32（d，J=8.05 Hz，2H，PhH），7.20（d，J=8.90 Hz，2H，PhH），6.80（s，1H，PhH），6.65（d，J=6.90 Hz，1H，CH），6.45（d，J=6.90 Hz，1H，CH），6.27（s，1H，ArH），2.43（s，3H，CH3）；13C NMR（125 MHz，DMSO-d6），δ：168.90，167.85，161.59，158.01，147.94，138.59，132.64，129.00，126.27，124.93，119.16，117.36，115.66，19.28；IR（KBr），ν~/cm-1：3350，3030，2945，1690，1636，1600，1380，1105，820，685；HRMS（Positive-ESIMS）（C22H16N6O2S计算值），m/z：429.1171（429.1178）［M+H］+.

1.2.4 测试溶液的配制 为了考察MNT 对Hg2+离子的识别性能,首先将探针MNT 溶解在2 mL 二甲亚砜(DMSO)中,然后转移至100 mL容量瓶中,加入二次蒸馏水配制成100 mL 2.0×10-5mol/L的MNT测试溶液[V(DMSO):V(H2O)=1:49].用二次蒸馏水分别配制浓度为2.0×10-5mol/L 的不同离子溶液[KH2PO4,CaCl2,NaF, MgSO4, AlCl3, ZnCl2, FeCl2·4H2O, Pb(NO3)2, Cu(CH3COO)2, Hg(CH3COO)2, AgNO3, CoCl2·6H2O, NiSO4·6H2O和BaCl2·2H2O],备用.

1.2.5 实际样品的检测 分别以自来水、海水(取自大连渤海海域,测试前先过滤掉其中的泥沙)和河水(取自大连西山水库,测试前先过滤掉其中的泥沙)作为待测水样,加入探针MNT后测定荧光发射光谱,并采用标准加入回收法进行实验.

2 结果与讨论

2.1 MNT对Hg2+的选择性识别能力

将2.0×10-5mol/L 的MNT 探针测试溶液分别与上述配制的浓度为2.0×10-5mol/L 的各种离子溶液等体积均匀混合，其中所含阳离子为K+，Ca2+，Na+，Mg2+，Al3+，Zn2+，Fe2+，Pb2+，Cu2+，Hg2+，Ag+，Co2+，Ni2+和Ba2+，相应的阴离子为H2PO-4，Cl-，F-，，和CH3COO-，室温下静置2 h，在激发波长λ=332 nm，激发和发射狭缝宽度均为5 nm 的条件下，测定探针的荧光发射光谱.

由图1可见，在MNT 探针溶液中加入Hg2+后溶液的荧光发生猝灭；而加入其它金属阳离子和阴离子后，溶液的荧光强度无显著变化；加入Cu（CH3COO）2后荧光强度也无显著变化.这说明铜离子和醋酸根离子均对猝灭无明显影响，也说明加入醋酸汞后发生显著的荧光猝灭源于Hg2+，表明MNT可以高选择性地检测Hg2+.

Fig.1 Fluorescence spectra for probe MNT with addition of different ions

2.2 MNT对Hg2+的荧光滴定光谱

为了进一步研究探针MNT对Hg2+的检出限，在探针测试液中（2.0×10-5mol/L）加入等体积不同浓度的Hg2+溶液进行了荧光滴定实验.由图2（A）可见，随着Hg2+的浓度逐渐增加，荧光强度逐渐减弱.当Hg2+浓度大于4.4×10-5mol/L 后，荧光猝灭程度不再改变.在探针与Hg2+等体积的条件下，Hg2+浓度在0～4.4×10-5mol/L范围内与探针MNT荧光强度呈良好的线性关系［图2（B）］.根据公式D=3σ/k［27］计算可得探针MNT对Hg2+的检出限为6.35×10-8mol/L，R2>0.99.

Fig.2 Fluorescence intensity of probe MNT upon addition of Hg2+(A)and the linear relationship of probe MNT with the concentrations of Hg2+(B)

2.3 MNT对Hg2+识别的抗干扰能力

为了研究其它金属阳离子及阴离子共存时对探针MNT识别Hg2+的影响，进行了干扰性实验.结果表明，在2.0×10-5mol/L的MNT测试液中分别加入其它金属离子及阴离子时，均无明显猝灭；继续加入Hg2+后，荧光几乎消失（见图3）.这表明其它金属离子及阴离子存在时对探针识别检测Hg2+无影响，探针对Hg2+的识别检测具有较强的抗干扰能力，表现出优异的专一性与高选择性.

Fig.3 Fluorescent recognition of probe MNT with addition of various metal ions with Hg2+

Fig.4 Fluorescence intensity changes of MNT in the absence(a) and presence(b) of Hg2+ under the varied pH values

2.4 pH值对探针MNT检测性能的影响

分别用浓度为2.0×10-5mol/L 的MNT 溶液以及等量Hg2+与MNT 的混合溶液考察了pH 值对探针性能的影响.由图4可见，在pH=2～13范围内，MNT荧光强度几乎无变化，探针表现出在较宽pH范围的稳定性；在探针溶液中加入Hg2+后，在pH=4～13范围内均产生显著的荧光猝灭；当溶液的pH<4或>12时，虽然对Hg2+的识别有一定程度的影响，但仍表现出较好的荧光猝灭效果，表明探针MNT可以在较宽的pH范围内检测Hg2+.

2.5 MNT对Hg2+识别的时间响应

通过荧光光谱研究了探针MNT 对Hg2+的响应时间.由图5可见，当将Hg2+加入探针溶液后，体系在25 s 内荧光强度减弱，25 s 后荧光猝灭强度趋于平稳，表明探针MNT对Hg2+的识别具有高灵敏性和稳定性.

2.6 MNT的荧光量子产率

对MNT探针固体运用Fluo Essence软件进行荧光量子产率的测定.根据物质的激发波长（λex）和发射波长（λem）调整参数，在λex=332 nm，λem=415 nm时测得样品的荧光量子产率为46%，斯托克斯位移为83 nm.

2.7 Hg2+猝灭机理探究

通过核磁滴定实验研究了探针MNT 对Hg2+识别的机理.向探针MNT 的DMSO-d6溶液中滴加Hg（OAc）2的DMSO-d6溶液，发现酰胺键中与氮原子键合的质子信号逐渐消失，喹啉酮苯环和碳碳双键上的质子信号均不同程度地向低场移动，并且双键上的2个质子信号不同程度地增强（图6）.根据Hg2+的配位特征［28］可以推断，探针分子中的酰胺键发生异构化后，一方面整个探针分子转变为大的共轭体系，另一方面酰胺键异构化后的氧原子和1，2，4-三唑［3，4-b］-1，3，4-噻二唑环中的氮原子与Hg2+配位，缺电子1，2，4-三唑［3，4-b］-1，3，4-噻二唑组块对电子迁移作用的影响进一步提升了荧光猝灭的效果，与文献［22～24］结果相比，探针对Hg2+的检测限得到提高，荧光识别的灵敏性增强，表明探针整体分子结构设计合理，达到了预期目的.

Fig.5 Effect of time on the fluorescence responses of probe MNT to Hg2+

Fig.6 1H NMR spectra of MNT(a)and MNT+Hg2+(b)

Fig.7 Job’s plot for the evolution of binding stoichiometry between sensor MNT and Hg2+

为了进一步确定探针与Hg2+的配位比例，通过Job’s 曲线滴定实验计算了MNT 与Hg2+的配位比（图7）.基于探针MNT+Hg2+的总浓度为10 μmol/L的连续变化绘制出图像，在配位比约为0.68时Job’s曲线出现拐点，表明MNT 与Hg2+之间的配位比为2∶1，由此推测的探针MNT 与Hg2+的配位模式如Scheme 2所示.

Scheme 2 Coordination mode diagram of probe MNT and Hg2+

2.8 实际水样中Hg2+的识别检测

为了深入评估MNT探针的实际应用价值，采用自来水、海水和河水3种实际水样，利用该探针对Hg2+进行了荧光检测.向2 mL 2.0×10-5mol/L MNT 探针测试溶液中分别加入2 mL 2.0×10-5mol/L Hg2+.

由图8可见，在实际水样中加入Hg2+后MNT探针荧光猝灭效果显著，表明探针在实际水样中可以灵敏检测Hg2+，且具有较高的稳定性.

为了研究实际水样中MNT 探针对Hg2+定量检测的效果，利用标准加入回收法检测了实际水样中的Hg2+［29］，结果如表1 所示.可见，不同水样中Hg2+的回收率在93%～112%之间，精确度良好，即MNT 探针在实际水样中对Hg2+的定量检测效果良好.

Fig.8 Fluorescence spectra of probe MNT towards Hg2+in real water samples

Table 1 Detection results of Hg2+in real water samples using probe MNT

3 结 论

依据Hg2+的配位特征，以喹啉酮为荧光团，拼合1，2，4-三唑［3，4-b］-1，3，4-噻二唑，合成了新型结构的荧光探针（E）-N-（4-甲基-2-氧代-1，2-二氢喹啉-7-基）-3-（3-苯基-［1，2，4］三唑［3，4-b］［1，3，4］噻二唑-6-基）丙烯酰胺（MNT）.研究发现，该探针对Hg2+具有特异性荧光识别检测效果，检出限达6.35×10-8mol/L，且在pH=4～13范围内均能高选择检测Hg2+，拓宽了荧光检测应用的pH范围.借助核磁滴定实验，一方面验证了探针与Hg2+发生配位，另一方面确定了荧光识别检测机理，同时通过Job’s曲线确定了探针分子与Hg2+的配位比为2∶1.MNT探针对Hg2+的识别检测具有快速灵敏、选择性高和抗干扰性强的特性，并可应用于实际水样，为其在环境监测等方面的应用提供了重要的参考.