颜范勇，孙中慧，庞纪平，江英霞，陈 圆

（1.天津工业大学化学与化工学院,分离膜与膜工艺国家重点实验室/国家分离膜国际联合研究中心,天津300387；2.天津中新药业集团股份有限公司中新制药厂,天津300450）

槲皮素（QCT）是自然界中常见的黄酮醇之一，由于具有抗过敏、抗病毒、抗癌及保护心血管等多种生物效应，引起了研究人员的广泛关注［1～4］.QCT 还具有抗氧化的生物功能，可清除细胞内的自由基，影响细胞的氧化还原状态.由于QCT 的功效与其含量相关，因此，定量测定QCT 在生物医学、生物化学和临床医学等领域均具有重要意义.目前，用于定量测定QCT 的方法主要有质谱法、电分析法、电化学法、高效液相色谱法和荧光检测法等［5～8］.其中，荧光检测法由于操作简便、特异性和灵敏性高而备受关注.然而，目前用于检测QCT的荧光探针存在一些缺陷，如检测过程易受其它黄酮类的干扰；并且常用的荧光分子和量子点具有细胞毒性，从而限制了它们在生物领域中的应用［9～12］.因此，制备一种低/无毒的光学传感材料，用于选择性和灵敏地检测QCT至关重要.

碳点（CDs）作为一种粒径小于10 nm的碳基零维纳米材料，由于其独特的光致发光特性和优异的光稳定性，可作为传统的重金属基量子点的无毒替代品，在生物传感、光学器件和医学等领域中显示出巨大的潜力.在生物传感领域，CDs 通常用于检测金属离子以及其它无机离子，如Fe3+，Hg2+，Al3+，F－，NO2－和OCl－等.但是，关于CDs在有机化合物中应用的研究仍然十分有限［13～16］.目前，有很多制备CDs的方法，最常见的有微波法和水热法［17～20］.通过一步合成法得到的CDs经常由于表面缺少对检测物的特定识别基团和低的量子产率而不能用于靶向性检测［21～23］.因此，杂原子掺杂和通过化学反应等手段对CDs表面进行修饰显得尤为重要.我们［24，25］已多次对CDs进行表面修饰，构建了检测分析物的传感平台.通过表面修饰，CDs通常会表现出更高的量子产率和显著的特异性识别能力［26～28］.

本文以无水柠檬酸为碳源，乙二胺为氮源，通过一步水热法合成了富含羧基的CDs，并通过酰胺化偶联反应将苯并噻嗪衍生物（BT）修饰到CDs表面得到CDs-BT.通过透射电子显微镜（TEM）、X射线光电子能谱（XPS）、荧光光谱、紫外光谱和红外光谱（FTIR）对合成的CDs-BT 进行了表征.结果表明，与原CDs相比，CDs-BT的荧光发射峰有35 nm的红移，并且可以实现对QCT的特异性检测.基于优化条件下QCT对CDs-BT的荧光猝灭现象，开发了一种基于CDs-BT荧光探针，用于快速、选择性和灵敏地检测银杏叶茶中的QCT，并具有较高的回收率.

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

无水柠檬酸、2-氨基硫酚、1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐（EDC）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；乙二胺、喹啉、邻苯二酚和间苯二酚购自天津市大茂化学试剂厂；QCT、黄岑素、大豆素、银杏素和芦丁购自上海麦克林生化科技有限公司.所用试剂均为分析纯，实验用水为二次蒸馏水.

VECTOR-22型傅里叶变换红外光谱仪（德国Bruker公司）；F-4500型荧光分光光度计（日本日立公司）；TU-1901型双光束紫外-可见分光光度计（北京普析通用公司）；EDAX GENESIS 60S型X射线能谱仪（美国伊达克斯有限公司）；JEOL-2010F型透射电子显微镜（日本电子株式会社）.

1.2 2-(3-氧-3,4-二氢-1,4-苯并噻嗪-2-基)乙肼(BT)的合成与纯化

参照文献［29］方法合成BT，合成路线如Scheme 1所示.将2.14 mL 2-氨基硫酚、1.96 g马来酸酐、25 mL 甲醇和2 mL 浓硫酸加入到100 mL 三口烧瓶中，超声10 min 后加热回流反应2.5 h.待反应混合物冷却至室温后，用5%的碳酸氢钠溶液洗涤，并用二氯甲烷进行萃取，得到2.75 g中间产物.将其溶解在70 mL 无水甲醇中并加入过量的水合肼，其与中间产物的摩尔比为2∶1.加热回流4 h，反应结束后冷却结晶得固体产物，用蒸馏水洗涤，再用甲醇重结晶得到BT.1H NMR（500 MHz，DMSO-d6），δ：2.69（d，2H，CH2），3.82（t，1H，CH），4.22（s，2H，NH2），6.98～7.30（m，4H，ArH），9.09（s，1H，NH），10.66（s，1H，ring NH）.收率为71%，熔点为190～192 ℃.

Scheme 1 Preparation procedure of BT,CDs and CDs-BT

1.3 CDs的合成与纯化

准确量取0.16 mL 乙二胺和1.35 g 无水柠檬酸于50 mL 烧杯中，加入30 mL 去离子水超声使其溶解，将溶液倒入50 mL水热反应釜中于190 ℃加热5 h.反应完成后自然冷却至室温，得到深棕色溶液.以4000 r/min转速离心15 min，去除溶液中的不溶性颗粒.取上层清液进行透析纯化（MW=3500），透析时间为24 h，以除去体系中未反应的前体化合物.将透析后的反应体系真空旋转蒸发至干，得到0.97 g纯的CDs产物（Scheme 1）.

1.4 CDs-BT的合成与纯化

称取0.12 g CDs并用20 mL甲醇溶解，使用PBS缓冲液调节溶液pH为6～7.向其中加入0.3 g EDC并在室温下搅拌30 min 活化CDs 表面的羧基.活化完成后，依次向反应混合物中加入0.15 g NHS 和0.15 g BT，于室温下搅拌24 h并用薄层色谱监测反应.反应结束后，旋转蒸干溶剂.通过柱层析法分离粗产物，首先用湿法装柱（层析柱规格为45 mm×450 mm，硅胶型号为200～300目），然后用少量的展开剂［V（二氯甲烷）∶V（甲醇）=20∶1］溶解待分离粗产物，加样，然后将下面的活塞打开，待溶剂层下降至石英砂面时，加入棉花，然后缓慢、多次加入洗脱剂，之后通过薄层色谱跟踪分离进程.最终，合并所需产物并用旋转蒸发仪浓缩得到0.11 g CDs-BT（Scheme 1）.精密称量0.0068 g BT-CDs，用去离子水充分溶解后定容至50 mL，配成浓度为0.2×10-3mmol/L的标准母液.

1.5 QCT的测定

QCT的检测在室温下HEPES缓冲液（10 mmol/L，pH=7.8）中进行.首先配制浓度为2.0 mmol/L的QCT 等有机物和阴阳离子储备液.所有测试溶液通过以下步骤制备：将100 μL CDs-BT 母液添加到10 mL 容量瓶中，然后添加不同体积的QCT 储备液（10，20，30，40，…，120 μL）并用HEPES 缓冲液定容.混合溶液充分摇匀后于室温静置15 min，然后以370 nm的激发波长记录CDs-BT的荧光强度变化.作为比较，还检测了CDs-BT 对黄酮类物质、酚类化合物和某些阴阳离子的荧光反应，激发波长均为370 nm，激发和发射狭缝均为2.5 nm.

1.6 QCT检测条件的优化

在响应曲面法（RSM）中，中心复合设计（CCD）是用于建模和优化的常用实验设计，通过此方法可找出pH、时间和温度相互作用下达到检测结果的最佳实验条件.本实验希望通过CCD和RSM在不同pH、孵育时间及温度的情况下找出探针BT-CDs检测QCT的最佳条件.荧光响应与检测变量之间的关系如下所示：

式中：X1，X2和X3分别代表pH、孵育时间和温度.式（1）是由Design-Expert 软件自动对模型进行拟合，然后根据残差对各种因素的贡献做方差分析后根据实际因素得出的［30～32］.

1.7 银杏叶茶中QCT的测定

银杏叶茶购买自天津某超市.取1.0 g 银杏叶茶，将叶片放入研钵中研磨至粉末，向其中加入20 mL 水超声30 min.将上述混合物以8000 r/min 转速离心15 min，取出上层清液，并用0.45 μm 的滤膜过滤除去不溶性杂质.将所得滤液用水稀释1000倍，待测.在最佳条件下，将100 μL CDs-BT 母液加入10 mL容量瓶中，然后加入不同浓度的QCT溶液，并用HEPES缓冲液定容，摇匀.静置15 min后，在370 nm激发波长下测定溶液的荧光强度.

2 结果与讨论

2.1 CDs-BT的表征与光学性质

CDs-BT的形态和粒径通过TEM表征.由图1（A）可见，合成的CDs-BT为具有良好分散性的准球形颗粒，粒径主要分布在1.2～4.0 nm 范围内，具有较窄的尺寸分布，平均粒径约2.35 nm.将FTIR 和XPS用来测定CDs-BT的表面官能团和元素组成.图1（B）为CDs，BT和CDs-BT在4000～500 cm-1范围内的 FTIR 谱图.与 CDs 和 BT 相比，CDs-BT 的 FTIR 图中 1700 和 1640 cm-1处的伸缩振动峰是酰胺键中C=O 与C—N 的吸收峰，说明CDs 与BT 在反应过程中形成了酰胺键；3400 cm-1附近的峰为N—H 或O—H 的伸缩振动峰，归因于CDs-BT 表面上—NH2或—COOH 以及BT 上—NH—的伸缩振动；1450 和1200 cm-1附近的峰归属为BT 上C=C 和C—N 的伸缩振动峰.以上结果说明，BT 已偶联在CDs 表面.将XPS光谱用于表征CDs-BT的元素组成.图1（C）显示，CDs-BT的XPS谱图主要由位于285.2，401和531.2 eV处的C1s，N1s和O1s3组吸收峰构成，说明CDs-BT主要由碳，氮和氧元素构成.CDs-BT的C1s谱图主要由3 组吸收峰构成［图1（D）］，285.7，287.6 和290.1 eV 处的吸收峰分别对应于C—C/C=C，C—N/C—O和C=O键；N1s谱图在399.2和400.6 eV的吸收峰分别对应于吡咯氮和N—H键［图1（E）］；O1s谱图在530.5和532.2 eV的2个吸收峰分别对应于C—O和C=O键［图1（F）］.上述结果证实了酰胺键的存在，表明确已合成CDs-BT.

将紫外吸收和荧光光谱用来表征CDs-BT的光学性质.图2（A）为CDs，BT和CDs-BT的紫外吸收光谱，CDs在336 nm处的特征吸收峰是由C=O的n-π*跃迁引起的.BT在235和276 nm处有2个吸收峰，归因于不饱和C=C的π-π*电子跃迁和C=O的n-π*电子跃迁.共轭完成后，CDs-BT 的谱图中出现了CDs 和BT 的共同特征峰.CDs 和CDs-BT 的荧光光谱分别如图2（B）和（C）所示，激发波长从300 nm增加到430 nm的过程中，CDs和CDs-BT的荧光强度均先增加后降低，并且表现出激发决定发射的荧光性质.当激发波长为360 nm时，CDs的最佳发射峰位于443 nm；当激发波长为370 nm时，CDs-BT的最佳发射峰位于470 nm.修饰完成后，CDs-BT的最佳激发和最佳发射峰均出现了红移.实验考察了pH、紫外辐射时间和温度对CDs-BT 荧光强度的影响.如图2（D）所示，当pH在3～13的范围内，CDs-BT 的荧光强度呈现出先增加后降低的趋势，且荧光强度值的波动范围为-0.6%～5.25%，表明表面基团的质子-去质子化对CDs-BT的电子跃迁影响较小.如图2（E）所示，用360 nm的UV光束连续照射CDs-BT溶液（0.01 mg/mL）时，每隔3 h记录下的荧光强度变化表明CDs-BT具有较好的光稳定性.图2（F）进一步表明，CDs-BT在15～40 ℃下具有良好的光稳定性.

Fig.1 TEM image and corresponding particle size distribution(inset) of CDs-BT(A), FTIR spectra of CDs,BT and CDs-BT(B),XPS spectrum of CDs-BT(C)and relative C1s,N1s and O1s spectra(D—F)

2.2 CDs-BT的选择性识别

直接使用CDs无法检测QCT.在探针BT-CDs的荧光选择性实验中，取200 μL CDs-BT母液于容量瓶中，加入120 μL 浓度为2×10-3mol/L 的黄酮类物质（黄岑素、大豆素、银杏素或芦丁）、酚类化合物（喹啉、邻苯二酚或间苯二酚）和某些阴阳离子，用HEPES缓冲液定容，室温静置15 min后测定CDs-BT荧光强度的变化.与QCT 性质相似的黄酮类物质和富电子的酚类化合物对CDs-BT 的猝灭程度如图3（A）所示，QCT可以明显猝灭CDs-BT的荧光，而其它物质对CDs-BT荧光的影响很小.向CDs-BT中加入某些离子后发现也只有QCT对CDs-BT有明显的荧光猝灭现象［图3（B）］，这说明CDs-BT可用于对QCT的选择性识别.而直接使用CDs却无法检测QCT［图3（C）］.

Fig.3 Selective experiments of CDs-BT on flavonoids and phenolic compounds(A)and certain cations and anions(B);fluorescence response of CDs to QCT(C)

2.3 CDs-BT对QCT检测条件的优化

CDs-BT对QCT检测的最佳条件通过CCD和RSM进行评估［31，32］.通过相关系数R2=0.9876和调整后的R2=0.9586的一致性可以说明实验数据与经验模型之间有显著的相关性，显示该方法可很好地预测各个条件相互作用时对荧光强度作用的关系.图4（A）表明了模型预测值与实际数据之间的关系，可见实验数据呈线性分布，表明实验中建立的模型与实际数据之间具有足够的一致性.图4（B）是残差的正态概率图，图中直线表明残差近似落在一条直线上，表明实验误差呈正态分布.图4（C）中不规则残差与实验次数之间的关系表明，该实验模型可以对实际数据进行适当的呈现.

Fig.4 Conditions optimization for QCT detection

图4（D）～（F）示出了2个因素作用下对CDs-BT的荧光强度的影响.其中，1，0.5，0，-0.5和-1依次代表的pH 值为 3，5，7，9 和11；代表的时间依次为 5，10，15，20 和25 min；代表的温度分别为5，15，25，35和45 ℃.横坐标分别代表温度、pH以及时间，纵坐标代表CDs-BT的荧光强度与加入QCT在相应条件下后的荧光强度之差.图4（D）为在温度和pH 2个因素影响下的荧光变化，可以看出，随着温度的升高，探针的猝灭程度降低，最佳检测温度为25 ℃；同时，弱碱性有利于探针的猝灭，当pH=8时最适合探针检测QCT.图4（E）为在温度和时间2个因素影响下的荧光变化，可以看出，随着时间的增加，探针的猝灭程度增加，最佳检测时间为15 min.图4（F）为在时间和pH 2 个因素影响下的荧光变化.因此，温度为25 ℃，时间为15 min，pH=8为最佳检测条件.

2.4 CDs-BT对QCT的荧光检测与机理

在最佳的实验条件下，研究了向CDs-BT中加入不同浓度的QCT对其荧光强度的影响.如图5（A）所示，CDs-BT 的荧光强度随着加入QCT 浓度的增加而降低.图5（B）为CDs-BT 的荧光响应（F0-F）与QCT的线性响应关系图，可见当QCT的浓度在2～22 μmol/L范围内时，其与CDs-BT的荧光强度有较好的线性关系，根据3σ/k计算得到CDs-BT对QCT的检出限为0.717 μmol/L.

通常，CDs 的猝灭机理主要包括静态猝灭、动态猝灭、内滤效应（IFE）和福斯特共振能量转移（FRET）［33～35］.在探究 CDs-BT 对 QCT 的检测机理时首先测定了 CDs-BT 中加入 QCT 前后的荧光衰退曲线，由图5（C）可知，CDs-BT的荧光寿命为11.34 ns，而加入QCT之后CDs-BT的荧光寿命为11.11 ns，CDs-BT 的荧光寿命在加入QCT 后并未改变，因此可排除动态猝灭和FRET 的可能.随后测定了CDs-BT、QCT 和加入QCT 后CDs-BT 的紫外-可见吸收光谱.如图5（D）所示，加入110 μL QCT（22 μmol/L）后，在345 nm 附近出现了新的吸收峰，该峰既不是CDs-BT 的吸收峰，也不属于QCT 的吸收峰，说明QCT的加入会影响CDs-BT的紫外吸收，排除IFE的可能.因此，我们认为CDs-BT与QCT相互作用的机理为静态猝灭.如图5（E）所示，经过表面修饰后，CDs-BT表面含有丰富的碱性基团（酰胺基和氨基），在QCT 的“硬软酸和碱的理论”中，酚羟基属于软酸，QCT 上最酸性的质子是酮羰基邻位的羟基位点，pKa为6.74［36～38］.因此，QCT上的3-羟基位点将通过静电作用与CDs-BT表面的碱性基团相互作用，并最终导致CDs-BT的荧光猝灭.因此，CDs-BT与QCT之间的相互作用为静态猝灭机制.

Fig.5 Fluorescence titration spectra of CDs-BT(A), linear relationship between F0-F and QCT concentration(B),fluorescence decay curves in the presence and absence of QCT(C), UV-Vis absorption spectra of CDs-BT,QCT and CDs-BT+QCT(D)and schematic diagram of QCT detection mechanism(E)

2.5 银杏叶茶中QCT的加标实验

为了验证合成的CDs-BT 可以选择性识别银杏叶茶中的QCT，进行了实际样品中QCT检测的加标回收实验，结果如表1所示.银杏叶茶样本中QCT的回收率为97.4%～101.6%，表明合成的CDs-BT可用于实际样品中QCT的检测.

Table 1 QCT spiked determination results in Ginkgo leaf tea samples

3 结 论

用柠檬酸和乙二胺合成了表面富含羧基的CDs，并以该CDs为基础通过酰胺化偶联反应与苯并噻嗪衍生物偶联构建了检测QCT 的荧光探针（CDs-BT）.通过TEM，XPS 和FTIR 表征了CDs-BT.通过CCD 和RSM 对CDs-BT 检测QCT 的实验条件进行了评估，得到用于检测QCT 的最佳实验条件：温度25 ℃，时间15 min，pH=8.在最佳实验条件下，QCT 浓度在2～22 μmol/L 的范围内与QCT 的荧光响应F0-F有较好的线性响应关系，检出限为0.717 μmol/L.研究发现，CDs-BT与QCT的相互作用机理为静态猝灭.CDs-BT还可用于实际样品银杏叶茶中QCT的检测，回收率为97.4%～101.6%.