彭 伙，高则航，3，廖承悦，王晓冬，周洪波，赵建龙

（1.中国科学院上海微系统与信息技术研究所,传感技术联合国家重点实验室,上海200050；2.中国科学院大学,北京100049；3.上海科技大学信息科学与技术学院,上海201210；4.北京旌微医学工程研究院有限公司,北京100176）

聚合酶链式反应（PCR）是一种能将少量的初始核酸中特定片段复制出数百万拷贝的核酸体外扩增技术，已成为分子生物学领域不可或缺的核心技术之一［1，2］.目前，常用的PCR 技术为实时荧光定量PCR（qPCR）技术［3～5］.qPCR技术通过检测反应过程中荧光强度的变化，实现对每个循环扩增后PCR产物的监测，并利用循环阈值（Ct）以及由已知浓度样品得到的标准曲线，对核酸原始浓度进行相对定量.然而，由于与标准曲线的对照必不可少，PCR 效率的差异会显著影响定量结果的可靠性［5，6］.同时，由于基体效应的影响［7］，导致检测精度和灵敏度较低，不易分辨微小浓度差异，难以有效检测含量低于1%的微量突变基因［8］.

数字聚合酶链式反应（dPCR）是Vogelstein和Kinzler［9］于1999年提出来的一种核酸绝对定量检测技术，具有高精度、高灵敏度及绝对定量等优势.其原理是将待测样品分散到大量相互独立、体积均一的微单元中，再进行PCR扩增反应，反应结束后统计各单元情况，存在荧光信号的微单元为阳性，记为1，无荧光信号的微单元为阴性，记为0，利用泊松统计得到初始DNA分子含量（初始拷贝数）.DNA分子在微反应单元中的分布情况可以用泊松分布描述，即1个单元中含有DNA分子的概率为

式中：k为该单元中DNA拷贝数；λ为微单元中DNA分子的平均数.根据公式（1）以及统计得到的阳性单元所占比例P和微单元体积v，可以通过下式得到待测样品浓度c：

dPCR这种“分而治之”的思路，既可以增加目标核酸分子的有效浓度，从而提高检出限（LOD）［10］，实现DNA单分子检测［8，11，12］，还可以降低目标核酸附近干扰物的含量，提高复杂背景下低丰度模板核酸的扩增效率，目前已在癌症诊断等方面展开应用［13］.

dPCR技术根据样品的分散方式可以分为微腔式与微液滴式.微腔式dPCR（cdPCR）技术利用大量微腔室将样品进行物理隔离分散成多份，目前已发展出多种类型，但其广泛应用受到限制.早期的孔板式cdPCR［9，14～16］分区数目少且操作繁琐.Matsubara 等［17］利用刻蚀工艺加工制造了微孔阵列芯片，将分区数目提升至1248，但在样品分散过程中每个微孔呈开放状态，存在较大的交叉污染风险.Heyries等［18］构建了具有百万个微腔的cdPCR芯片，首先利用PDMS的透气性，用反应试剂无死角填充芯片的微通道与微腔室，再利用与水不互溶的油相将连通各微腔室的微通道中的反应试剂排出，从而实现分散.Zhu等［19］在此基础上开发出自吸入cdPCR芯片，通过对芯片脱气处理实现自吸入试剂.然而，由于微腔与微通道高度不一，其模具制造时需进行对准光刻，同时此类芯片具有3层以上的结构，制造工艺相对复杂，加工成本较高.此外，cdPCR芯片对大范围内微加工的均一性要求较高［16～20］.

液滴数字PCR（ddPCR）是一种基于液滴微流控技术的dPCR 技术，具有通量高、分散效率高的特点，能够以高达数十kHz 的通量将样品分散至体积在纳升甚至皮升量级的微液滴中进行PCR 反应［21，22］.在微通道中产生液滴的最常用方法为T字型和流动聚焦型，利用流动的油相剪切分散相形成单分散液滴［23～25］.这类液滴的产生方式可通过调节两相流量比改变液滴尺寸，使作为微反应单元的液滴体积与数量灵活可调.同时，液滴通常由单个发生器产生，对大面积的微细加工均一性要求相对较低.ddPCR的技术方案主要分为2类.一类是将“液滴产生-反应-结果读出”分别在3个结构中完成，主要流程是将微通道中产生的液滴收集在类似离心管的结构中进行PCR热循环，再导入微通道，采用类似流式细胞计量的形式逐个识别其阴阳性［11］.但液滴不能承受高的流体剪切，液滴识别的通量受限［22］.另一类是液滴平铺式方案，即将液滴产生器与液滴收集腔集成于同一芯片中，且液滴收集腔高度与液滴直径相当，使收集的液滴在腔内成单层排列，利用显微拍照的形式对反应结果荧光成像［26］.这种方式可使液滴免受流体剪切影响，同时结果读出效率高，还可追溯液滴.但狭窄的液滴收集腔对气泡十分敏感，混入液滴之间的气泡可能会将乳液从反应室中移出，或在液滴上施加剪切力，从而导致液滴融合，影响实验结果［27］.已有一些微流控芯片通过合理的宽窄通道组合［28］以及多孔膜［29］来过滤气泡，但仅限于单相流体.此外，常用于产生液滴的油相——矿物油，会被液滴微流控芯片常用材料聚二甲基硅氧烷（PDMS）吸收.通常采用在PDMS中镶嵌玻璃［26］或用双面胶构建玻璃腔［30］来应对PDMS对油相的吸收，但前者不能完全避免吸收，后者液滴收集腔并未完全密封，存在交叉污染的风险.

本文提出一种新型的玻璃腔构建方法，并基于此方法构建了一种具有气泡过滤结构的高鲁棒性平铺式ddPCR 芯片.该方法构造的玻璃腔在液滴收集腔内通过玻璃与PDMS 的键合构造了玻璃材质的“天花板”，得到的模块再与玻璃基片构成玻璃腔，腔体高度略大于液滴直径，使液滴单层收集并进行PCR，避免保存液滴的油相被PDMS吸收.在构建玻璃腔的同时，构建了气泡过滤结构，可过滤掉体积大于样品的气体，进一步提高芯片的鲁棒性.还引入了镜面反射层，通过镜像效应扩展摄像机采集单个阳性液滴荧光的散射范围，缩短荧光成像时间，提高了检测效率.该芯片只有2个进样口和1个排气口，直径不超过3 mm，便于芯片整体密封，降低了交叉污染风险.利用该芯片对EGFR基因的检测可验证其在核酸定量检测方面的性能.

1 实验材料与方法

1.1 试剂与仪器

聚二甲基硅氧烷（PDMS，分析纯）购自美国Dow Coming 公司；矿物油（生物技术级）、Triton X-100（分析纯）和无菌去离子水（一级）购自美国Sigma Aldrich公司；Tween 20（分析纯）购自上海生工生物工程有限公司；ABIL EM90（分析纯）购自德国Evonik公司；上游引物、下游引物、MGB探针和EGFR基因第21号外显子基因序列的pGEM质粒购自上海占标生物科技有限公司.

用于ddPCR芯片反应的PCR原位扩增仪购自德国Eppendorf 公司；芯片进样气压泵购自苏州文灏公司；观察进样过程的IX73型显微镜及用于荧光成像系统的IX51型显微镜和DP80型CCD图像传感器均购自日本Olympus公司.

1.2 芯片制造

1.2.1 芯片结构设计 利用AutoCAD软件设计芯片的微通道结构，委托昆山凯盛电子有限公司加工制造相应的掩模片.

1.2.2 模具制作 在硅片上均匀旋涂一层SU8 光刻胶，并通过曝光显影得到具有微通道的模具［Scheme 1（A）］，然后在与液滴收集腔对应的模具结构区域粘合玻片G1.G1的水平投影尺寸与收集腔区域的尺寸（36 mm×21 mm）相同.在胶未固化时，用镊子调整G1，使其投影与Scheme 1（A）中模具的收集腔区域重合，得到最终模具［Scheme 1（B）］.

Scheme 1 Manufacturing process of ddPCR chip

1.2.3 ddPCR 芯片制备 将PDMS 单体与固化剂按质量比10∶1 混合均匀后浇入模具中，水平静置，待气泡完全释放后，于65 ℃加热2 h，冷却至室温，如Scheme 1（C）所示.将固化好的PDMS 从模具上剥离并按需求切块和打孔，再通过等离子键合在Scheme 1（D）中黄色区域键合玻片G2（单面溅射铝作为镜面反射层，铝层厚度100 nm，玻片尺寸33 mm×17 mm），形成“玻璃天花板”，玻片边缘与最近的红色微通道区域间隔WG1［Scheme 1（E）中虚线框内剖视图所示］为0.5～1 mm.此时，在微通道区域与玻片G2之间形成深槽，将得到的PMDS 模块再与玻璃基片G3键合，得到最终芯片，如Scheme 1（E）所示.最后，将得到的芯片于105 ℃加热8 h 以上，以增强芯片内微通道表面的疏水性.Scheme 1（F）为芯片实物图.

液滴收集腔高度h与玻片G1厚度hG1、玻片G2厚度hG2、微通道高度hm及玻片粘合时胶层厚度hj之间的关系为h=hG1+hm+hj-hG2.选用厚度一致的玻片G1和玻片G2时，h=hG1+hj.为了避免胶层的影响，在胶固化时将500 g的砝码压在玻片G1上，以减少胶层厚度.

1.3 进样与结果读取

为了观察液滴产生情况与保存情况，进样过程通常在显微镜载物台上进行.在进口1加入矿物油［3%（体积分数）EM90+0.1%（体积分数）Triton X-100］，在进口2 加入PCR 预混液，用多聚物管连接气压泵与芯片的进油口和进样口.在气压泵上设置进样压力，打开连接进油口的压力开关，2 s后打开连接进样口的压力开关，待样品消耗完毕，关闭连接进样口压力，待液滴收集腔被充满，关闭连接进油口压力.利用PDMS混合物封堵进油口、进样口与排气口，然后进行PCR反应.

利用IX51型荧光显微镜读取ddPCR反应结果.利用显微镜配套的DP80 CCD 图像传感器拍照记录反应结果，再将得到图片导入ImageJ软件，统计阳性液滴数目和液滴总数.最后，根据公式（2）计算目标DNA的浓度.

1.4 反应试剂

ddPCR 反应所用的探针和引物均用无菌去离子水稀释至10 μmol/L.引物包括上游引物和下游引物，探针为ROX标记的MGB水解探针，序列信息见表1.反应体系总体积为10 μL，包含5 μL 2×Light Cycler®480 Probe Master，0.4 μL引物，0.3 μL探针和1 μL DNA模板.

1.5 反应条件

将封装好的芯片转移至原位PCR 仪上进行PCR 热循环反应，循环过程如下：首先加热至95 ℃并保持10 min，激活酶活性；再经95 ℃变性15 s，60 ℃退火延伸30 s，并循环45 次；最后降温至室温.

Table 1 DNA sequences of primers and MGB probe

2 结果与讨论

2.1 液滴产生与收集

制备的芯片的主要结构如Scheme 2（A）所示，含有2个进口，1个出口.进口1为进油口，产生液滴所需的油相由此口加入；进口2为进样口，PCR反应预混液（以下称水相）由此口加入；出口可在进样过程中保持芯片内部与外部气压平衡.液滴产生接口采用流动聚焦型接口，如Scheme 2（B）所示，其中白色字母“w”为接口关键尺寸（25 μm）.液滴产生时，水相沿绿色箭头流入，油相沿蓝色箭头流入，剪切水相产生单分散的液滴.进油口与进样口常用的进样压力为25 kPa.为便于观察，黄色墨水用作水相，具有一定的透明度，故在黑白相机拍摄的图片中产生的液滴呈灰色.

该芯片可在10 min 内产生20 多万个液滴，半径约21 μm.液滴沿黄色箭头流向液滴收集腔.液滴收集腔与微通道之间存在1 个间隙，宽度（WG1）可选取0.5～1 mm，高度约1 mm，可过滤混入流体的气泡.液滴收集腔其它3 边到PDMS边缘距离WG2>1 mm，使腔内油相与PDMS之间有足够间隔，可避免被PDMS 吸掉.液滴进入收集腔后，则不再与PDMS 接触，从而使其稳定保存［Scheme 2（C）］.

Scheme 2 Structure of ddPCR chip

2.2 气泡过滤

气泡过滤结构主体为一个宽0.5～1 mm的深沟道，深度依玻片G2而定，如Scheme 3（A）所示.当油相进入沟道时，会沿沟道壁向上浸润.一些气泡进入深沟道时，因密度轻会上浮与液滴分离，同时接触空气，然后破碎，类似于肥皂泡.另一些气泡则被油相带到液滴收集腔边缘，进入狭窄的收集腔需克服界面张力差.通过二维近似，该压力差（ΔP）可表示为［28］

式中：γ为界面张力系数.黏滞力为驱动气泡移动的主要动力.毛细管系数（Ca）可用来定性描述黏滞力与界面张力大小的关系：

式中：μ为黏滞系数；U为流速.在微米尺度下，Ca≈10-2［31］，即气泡通常难以进入液滴收集腔.为了便于观察气泡的过滤情况，使用未溅射铝的玻片进行实验.在实验中，由于油水两相并非同时到达十字接口或加样操作不当会造成油相或水相中混入空气，空气通过液滴产生接口处，会形成小气泡.为了测试气泡过滤结构的极限性能，以红色墨水为水相，在黑白相机下呈灰色，并预留约30 μL空气，施压的加压力为常用的25 kPa.在进样初期［Scheme 3（B）］，大量空气以层流的形式在微通道中流动，经过缓冲区后进入过滤结构（红色虚线框区域），被拦截在过滤结构处.随着进样的持续进行，气泡逐渐像肥皂泡一样破碎消散，而样品进入微通道并形成液滴，再经过滤结构进入玻璃腔，如Scheme 3（C）所示.因油相浸润导致密封在微通道中的空气约0.2 μL，实际进样过程中不会存在如此大量的气泡.实验中追踪了1个正常进样时与液滴混合在一起的气泡，如Scheme 3（D）所示，黄色箭头所指即为所追踪的气泡.气泡与液滴进入液滴过滤处（红色虚线框区域）时，气泡停留在过滤结构内，而液滴则进入收集腔.这表明该过滤结构具有高效过滤气泡的能力，可有效过滤加样混入的空气，使液滴保存在无气泡的环境中.

Scheme 3 Principle and experimental process of filtering bubbles

2.3 荧光增强

在实际使用中，阳性液滴的荧光信号通常很弱，为有效捕捉检测荧光信号，通常采用延长液滴在激发光下曝光时间的方法，从而导致较长的检测时间.据文献［32，33］报道，微透镜阵列以及曲面反射镜阵列可显著增强荧光信号，但需要将已反应的液滴再注入检测器件中.为了与平铺式ddPCR芯片兼容，本文利用平面镜增强液滴的荧光信号.如图1（A）所示，平面镜可将液滴D背对镜头散射的荧光反射进入摄像机镜头，增大了入射光的通量，从而增强荧光信号.实验中在玻片G2一面溅射铝作为平面镜，用来制作ddPCR芯片进行反应测试，并以无铝层玻璃腔作为对照.利用荧光显微镜对2组反应结果进行拍照，如图1（B1）～（B4）所示.图1（B1）和（B2）为无铝层玻璃腔的ddPCR反应结果，曝光时间分别为2 s和1 s.图1（B3）和（B4）为带有铝层玻璃腔的ddPCR反应结果，曝光时间分别为2 s和1 s.可见，同等条件下带有铝层芯片的荧光照片亮度整体明显偏高.利用ImageJ软件读取不同曝光时间下荧光照片中液滴的灰度值，带有铝层的液滴与无铝层的液滴灰度差值约为20，并随着曝光时间的减少而降低，如图1（C）所示.这是由于荧光液滴需在激发光照射下才能发出荧光，而曝光时间即是激发光照射液滴时间.曝光时间减少致使液滴自身荧光减弱，故灰度增值同样降低.通过横向对比可以发现，灰度值相同时铝层的使用可使曝光时间减少约0.5～0.8 s，即减少约40%的曝光时间.

Fig.1 Fluorescence enhancement for the ddPCR chip

阴性/阳性液滴的识别统计是ddPCR技术的关键，主要是基于液滴荧光强度差异来确定荧光阈值，荧光信号大于阈值的液滴为阳性，低于阈值的为阴性.为了检验铝层对阴/阳液滴识别的影响，统计了曝光时间0.3～2 s范围内铝层对阳性液滴与阴性液滴的平均灰度差值的增长率，如图1（D）所示.当曝光时间为2 s时，增幅为负值，即两者灰度差值减小，表明铝层使阴阳液滴荧光强度差异降低；当曝光时间逐渐降低时，增幅为正值并逐渐增大，表明铝层使阴/阳液滴的荧光强度差异增加，并随曝光时间而增加.综上，铝层的使用缩短了曝光时间，还可提高阴性液滴与阳性液滴的识别度，从而有效降低扫描液滴所需时间，提高ddPCR芯片结果的读出效率.铝层玻璃腔中每个视野的荧光成像时间可缩短约40%.若再配合调节相机增益以及图像对比度等参数，曝光时间可降至百毫秒量级甚至更低.此外，玻片上致密的铝层能阻挡环境光，避免其对荧光检测的干扰，使芯片可以在非暗室环境下工作.

2.4 定量检测

为了考察所设计芯片的核酸定量检测能力，利用EGFR基因的21号外显子基因作为目标DNA分子检验了芯片的检测能力.将嵌入EGFR基因第21号外显子基因序列的pGEM质粒溶液10倍梯度稀释得到5个浓度的样品，检测结果如图2（A1）～（A5）所示，可见随着目标DNA浓度的降低，阳性液滴所占比例明显降低.图2（A6）为阴性对照.通过统计阳性液滴数目及液滴总数，根据公式（2）计算出每次实验所用样品浓度.根据各个样本的稀释系数与ddPCR 反应结果得到的浓度绘制标准曲线，如图2（B）所示.该芯片在检测浓度为101～105copies/μL范围内的靶基因时表现出良好的线性关系（R2=0.998）.

Fig.2 Quantitative detection results of EGFR exon 21

3 结 论

设计了一种具有增强荧光信号效果并具备过滤气泡能力的ddPCR芯片，实现了液滴产生、PCR反应以及反应结果读取一体化.利用该方法构建的玻璃腔可使收集的液滴稳定保存，并通过高度限制使液滴单层排列，便于后续检测.由深沟道构成的气泡过滤结构可有效过滤混入流体中的气泡，避免其进入液滴收集腔中破坏液滴保存环境，提高了芯片的鲁棒性，并使进样操作规范且简便.玻片的铝层可增强液滴的荧光信号，同时保证阴阳液滴的可识别度，可有效缩短荧光成像时的曝光时间，提高检测效率.通过对不同浓度EGFR 第21 号基因片段的定量检测，发现该ddPCR 芯片可对浓度为101～105copies/μL范围内的目标基因进行高灵敏度的绝对定量检测.综上，该芯片在核酸相关的检测领域具有较大的应用潜力.