制药工程专业实验阿法依伯汀的谱学分析与指认

2020-08-24金洁施琪浩蒋鑫章少阳张嘉琪董俊杰洪文燕秦利明张英杰钟爱国

当代化工 2020年6期

金洁　施琪浩　蒋鑫　章少阳　张嘉琪　董俊杰　洪文燕　秦利明　张英杰　钟爱国

摘要：利用 Gaussion 09W软件在DTF/B3LYP 6-311+G水平下优化并计算了新型基因兴奋剂促红细胞生成素阿法依伯汀（EPO）的四大分子光谱：紫外-可见吸收光谱，红外吸收光谱，拉曼吸收光谱以及核磁共振吸收光谱;计算了22种常见单取代衍生物的氢和氧原子信息指数，讨论了其在马拉松运动员体液酸碱性（pK_a）检测中的预报应用。所得结果可协助对阿法依伯汀分子光谱理解及体液检测。

关键词：制药工程实验;基因兴奋剂;促红细胞生成素;谱学分析

中图分类号：G822.8 文献标识码： A 文章编号： 1671-0460（2020）06-1107-04

Spectroscopic Analysis and Identification of Alfaibertin in Pharmaceutical Engineering Specialty Experiments

JIN Jie， SHI Qi-hao， JIANG Xin， ZHANG Shao-yang， ZHANG Jia-qi， DONG Jun-jie，

HONG Wen-yan， QIN Li-min， ZHANG Ying-jie， ZHONG Ai-guo^*

（College of Pharmaceutical， Chemical and Materials Engineering， Taizhou University， Taizhou Zhejiang 318000， China）

Abstract： Using Gaussion 09W software， the four macromolecular spectra of the novel gene stimulant EPO were optimized and calculated at DTF/B3LYP 6-311+G level： UV-Vis， IR， LM and¹HNMR，¹³CNM. R. Its specific application in marathon athletes' body fluid detection was discussed. The research is helpful for having a more perceptual understanding of the three-dimensional structure of erythropoietin molecule.

Key words： Pharmaceutical engineering experiments; Gene stimulants; Erythropoietin; Spectral analysis

藥物EPO是促红细胞生成素（erythropoietin）的英文简称^[1-3]。人体中的促红细胞生成素是由肾脏和肝脏分泌的一种激素样物质，能够促进红细胞生成。1985年科学家应用基因重组技术，在实验室获得重组人EPO。1989年安进（Amgen）公司的第一个基因重组药物阿法依伯汀（Epogen）获得FDA的批准，成为名副其实的"重磅炸弹"基因药物，创下了生物工程药品单个品种之最，是当今最成功的基因工程药物^[4]。国内已有10多家单位获准生产红细胞生成素阿法依伯汀（见图1）。

鉴于大剂量使用 EPO 对人体危害和对体育运动公平性的冲击，我国从1998年开始就对 7个体能项目进行血液检查，是世界上最早对 EPO 进行血检的国家之一。由于使用这种重组基因兴奋剂所产生的 EPO 与内源性的非常相似，目前还没有好办法区分开来。本文试图从波谱学和分子酸碱性两个角度分析其特征，所得结果可为运动员体液检测提供数据参考。

1 计算方法

PC电脑一台安装; Chem 3 D、GaussView 5.0.9、Gaussian 09 W、ACD-Labs 6.0、ChemDraw 8.0、Multiwfn 3.5、Origin 8.5等软件。通过 Multiwfn 3.5 软件来计算EPO分子的4种熵值（申农熵、费歇尔熵、二级费歇尔熵、Parr熵）。采用 ACD-Lab 6.0 软件测得的 pK_a的线性关系。用高斯软件等软件系统对EPO建模优化，并判断化学结构键对其酸度系数（pK_a）是否影响，此文将通过计算EPO及其衍生物的二级费歇尔熵、Parr 熵、申农熵、费歇尔熵与其酸性 pK_a值，来得到各类熵和酸度系数相关性线性方程，并选出其中相关性最高的关于预测酸度系数（pK_a）的线性方程。除此之外，此文还将通过软件模拟其红外（拉曼）光谱（IR）、紫外-可见光谱（UV-VIS）、核磁谱图（¹HNMR，¹³CNMR），来指认EPO的分子光谱。

2 结果与讨论

2.1 EPO分子骨架结构分析

EPO分子结构在很大程度上影响了其反应性、极性、相态、颜色、磁性和生物活性。分子结构涉及原子在空间中的位置，与化学键种类有关，包括键长、键角以及相邻三个键之间的二面角（见表1）。

2.2 EPO分子前线轨道分析

EPO分子及其常见5种单取代基衍生物的前线轨道图列于表2。其前线轨道能级差?E随着取代基顺序—H、—CH₃、—C₂H₅、—NH₃、—OH、—NO₂增大。

2.3 EPO分子光谱分析

2.3.1 紫外-可见吸收光谱

紫外吸收光谱是由于物质吸收紫外光导致价电子从低能级跃迁至高能级，产生了吸收峰形成的。通过分子对紫外光的吸收所产生的紫外可见光谱和吸收程度就可以对物质的组成、结构、含量进行鉴定。通过 GaussView 5.0.9 实现建模并计算，得到EPO的模拟吸收谱，用Origin 8.5进行谱图处理。图2显示EPO在 239.24 nm 处有最大吸收波长，在近紫外区范围内发生了n→σ^*跃迁。

2.4 红外-拉曼吸收光谱

在本中通过 GaussView 5.0.9 实现建模并计算，得到EPO红外吸收谱图和拉曼吸收光谱图（图3），频率则通过利用 Frequency 计算得到，最后用 Origin 8.5 进行谱图处理。拉曼光谱是印度物理学家 Raman 于 1928 年发现的，上述给我们通过拉曼光谱来实现对分子主要官能团与结构特征的探究提供材料。

EPO的红外光谱图的吸收峰如下：在776 cm^-1处的吸收峰是苯环上的一取代特征峰;在1 352 cm^-1处的吸收峰为 R—SO₂—OH 的反对称伸缩振动;在 1 504 cm^-1处的吸收峰为C—C的伸缩振动;在

3 960 cm^-1处的吸收峰为 C=O 的伸缩振动。在谱图中还存着某些吸收频率较小基团的吸收峰。EPO的拉曼光谱图的吸收峰如下：在 1 024 cm^-1处的吸收峰为单取代苯 C—H 的变形振动;在 3 360 cm^-1处的吸收峰为 C—H 对称伸缩振动;在 3 960 cm^-1处的吸收峰为 O—H 的对称伸缩振动。拉曼光谱图分析如图3（b）所示。拉曼光谱图的吸收峰如下：在1 584 cm^-1处的吸收峰为 OH 的对称伸缩振动;在

3 360 cm^-1处的吸收峰为 C—H 对称伸缩振动;在 3 960 cm^-1处的吸收峰为 C—H 的对称伸缩振动。

2.5 荧光-磷光发射光谱

通过高斯 09 软件实现 EPO 建模结构优化，荧光发射光谱图频率则通过 Energy 方法计算得到，再借助 Origin 8.5 作图分析如图4所示。图4a 显示了EPO 在 239.5 nm 处有最大发射波长，且在近紫外区范围内。而其磷光发射在249.9 nm 处（图4b），有较长发射波长的原因是发生分子内发生了电子 n→π* 跃迁。

2.6 核磁共振吸收光谱

核磁共振可用于测定分子中某些原子的数目、类型和相对位置。使用 GaussView 5.0.9 和 Origin 8.5 进行谱图处理。使用软件 Chem Draw 8.0 打开模型，采用 Predict 1 H-NMR shifts 和 Predict 13 C-NMR shifts 方法计算得到核磁光谱图，如图 5 所示。

3 反应活性分析

3.1 氢原子的信息理论指数与酸碱性分析

生命活动需要充足的氧气，当氧气不足时，细胞里的氧气含量下降，原本需要被清除的转录调控因子HIF-1无法降解，从而让低氧应答元件能指导细胞大量合成促红细胞生成素，进而制造更多的红细胞来运输更多的氧气。很久以前科学家们就发现，当氧气不足的时候，身体会合成一种叫做促红细胞生成素的物质（erythropoietin，EPO），它是一种糖蛋白激素，可以刺激骨髓生产更多的红细胞，让更多的氧气有机会被运输到身体组织里。北京时间10月7日，2019年诺贝尔生理学或医学奖共同授予William G. Kaelin Jr、Sir Peter J. Ratcliffe和 Gregg L. Semenza，以表彰他们在理解细胞感知和适应氧气变化机制中的贡献。生物体感受氧气浓度的信号识别系统是生命最基本的功能，然而学界对此却所知甚少。正是三位诺奖得主的研究揭示了其中的机制。本文用高斯等软件系统对EPO及其衍生物等对象建模优化，并判断取代基对其酸度系数（pK_a）是否影响。此文还将通过计算EPO及其衍生物的二级费歇尔熵I_F'、G_s、申农熵S_s、费歇尔熵I_F与pK_a值，来得到各类熵和酸度系数相关性线性方程，并选出其中相关性最高的关于预测酸度系數（pK_a）的线性方程。从而来实现对其他新型衍生物的酸度系数预测的目的（见表3）。

3.2 氧原子的信息理论指数与酸碱性分析

通过 GaussView 5.0.9 计算所得的苯磺酸及其 22 种衍生物 O、H 原子的申农熵（S_s）、费歇尔熵（I_F）、二级费歇尔熵（I_F）、Parr熵（G_s）和通过 ACD-Labs 6.0 预测得到的相应衍生物酸度系数（pKa），结果如表4所示。

为了更明显地表达出熵值变化与酸度系数（pKa）的线性关系，分别用EPO及其 22 种衍生物的申农熵（S_s）、费歇尔熵（I_F）、二级费歇尔熵（I_F）、Parr熵（G_s）的熵值与 pK_a值进行 Origin 作图分析，得出相关性系数。EPO及其 22 种衍生物 H 原子的申农熵与 pK_a值关系如图6a所示，相关系数为0.932 7，线性方程为y=126.024 57-74.388 98x。EPO及其 22 种衍生物 O 原子的申农熵与pK_a值关系如图6b所示，相关系数R为0.589 34，R²为0.287 99，线性方程为y=59.349 45-22.329 86x。

4 结论

通过高斯软件系统构建了EPO和它的22 种衍生物模型，优化筛选之后得出以下结论。

1）EPO及其22种衍生物的H、O 原子的申农熵（S_s）、费歇尔熵（I_F）、Parr熵（G_s）变化较小，而 H、O原子的二级费歇尔熵（I_F），变化较为明显，其中 H 原子的 Parr熵与pK_a的线性方程的R值最大（R为0.933 51，R²为0.859 75），即相关性最好。因此可运用Parr熵与pK_a的线性方程（y=137.821 69-31.603 53x）来预测其他EPO衍生物的酸度系数。