赵云龙，叶梅燕，王嘉婧，于 婷，张东鸣

（1.通化师范学院生命科学学院，吉林通化 134000；2.吉林农业大学动物科学技术学院，吉林长春 130118）

洛氏鱥（Phoxinus lagowskiiDybowski）也叫柳根子，属鲤形目（Cypriniformes）、鲤科（Cyprinidae）、雅罗鱼亚科（Leuciscinae）、鱥属（Phoxinus），是一种小型杂食性冷水鱼，肉质细嫩、美味又营养，在小型鱼类中颇具优势，深受消费者青睐。目前，北方地区洛氏鱥的人工养殖面积越来越大，前景喜人。随着水产养殖行业向绿色产业发展，对水产品的安全、无污染、无残留的要求日益严格，微生物发酵饲料越来越受到重视，与传统饲料相比，其优势在于可降低植物蛋白抗营养因子含量，改善蛋白质品质，提高营养价值[1]。

蜜环菌（Armillaria mellea）属于蘑菇目（Agaricales）、泡头菌科（Physalacriaceae）、蜜环菌属（Armillaria），具有极高营养和药用价值、能降低致病菌的入侵、调节免疫及抗氧化能力等多种效用，在药品、保健品、功能食品等领域中广泛的应用[2]，但尚未见在鱼类饲料领域中应用。因此，为了对蜜环菌发酵饲料在水产养殖中的应用效果进行科学评估，本试验从生长性能、免疫、抗氧化能力以及肠道菌群等方面入手，探讨蜜环菌发酵饲料对洛氏鱥生长性能及生理功能的影响，为蜜环菌发酵饲料在水产饲料中的应用和新型水产饲料资源的开发提供理论依据和参考。

1 材料与方法

1.1 试验饲料 4种发酵饲料原料组成及营养成分如表1所示。豆粕为蛋白质源，豆油和麦麸为脂肪源，青菜为维生素源。基础饲料中分别添加0、6、12、18 mL/kg蜜环菌菌液。原料进行粉碎后，按配方的各原料比例称重充分混匀，灭菌后在超净台上接入蜜环菌菌液，密封后在暗处发酵48 h（20℃）后，制成长度约3～4 mm的颗粒料，置于阴凉处风干，放入4℃的冰箱保存。蜜环菌菌液是以马铃薯、硫酸镁、磷酸二氢钾、葡萄糖、蚕蛹粉和维生素B1作为底物，接种蜜环菌发酵而成。

1.2 试验设计与饲养管理 经过1周驯养后，将360尾外观正常、健康活泼、初始体重量为（20.85±2.04）g、体长为（118.7±9.7）mm的洛氏鱥，随机分成4组，每组3个重复，每个重复30尾洛氏鱥，置于养殖容器（聚乙烯塑料水族箱，规格为75 cm×60 cm×50 cm）。

表1 基础饲料原料组成及营养成分

养殖期间按洛氏鱥平均体重的1% 投喂，每天08:00和17:00投喂。每隔1周测1次洛氏鱥的总重以调整投喂量。养殖用水先经曝气，每周换水1次（全部）。养殖期间水质条件为（18±2）℃、pH 7.0～7.5、溶解氧含量大于5.0 mg/L、氨氮含量小于0.01 mg/L、硫化物小于0.05 mg/L。养殖13周后，停止喂食，24 h后收集样品。

1.3 采样与分析

1.3.1 生长指标 参考钟小群等[3]测定方法。

成活率（SR）=Nt/N0×100%

增重率（WGR）=（Wt－W0）/W0×100%

特定生长率（SGR，%/d）=（lnWt－lnW0）/T×100

饲料系数（FCE）=F/（Wt－W0）

肥满度（CF，g/cm3）=Wt/L3×100

式中，N0为初始鱼尾数，Nt为末鱼尾数，W0为试验开始时鱼体总重（g），Wt为试验结束时鱼体总重（g），F为摄食量（g），T为养殖时间（d），L为末时鱼的体长（cm）。

1.3.2 免疫和抗氧化指标 样品测定数量为3尾/ 箱。解剖取肝脏，用吸水纸将采集的肝脏擦干，精准称取组织，冰浴条件下，按体积（mL）:质量（g）为9:1的比例加入9倍体积生理盐水，使用玻璃研磨器磨碎，装进离心管，4℃ 2 500 r/min离心10 min，取上清液。采用南京建成生物工程研究所试剂盒，测定肝脏溶菌酶（LZM）、超氧化物歧化酶（SOD）和总抗氧化能力（T-AOC），具体方法参照试剂盒说明书。

1.3.3 肠道微生物菌群 9尾/组（每箱3尾，混合）。每箱随机采集3尾鱼在无菌操作台中取出肠道部分；用无菌镊子挤出内容物后，将肠道剪开并用塑料刮板刮取肠道黏膜，将3尾鱼的肠道内容物和肠道黏膜样品混合存放于1.5 mL无菌Eppendorf管中并置于液氮中保存，共计12个样。根据16S rRNA基因V3～V4区序列，选择测序引物为341F：（5´-CCTAYGGGRBGCASCAG-3´）和806R：（5´-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3´）。纯化后的扩增产物在上海元莘生物医药科技有限公司通过Illumina PE250测序。通过比对Silva核糖体数据库，以97%相似性水平为标准划分可操作分类单元（OUT），并采用RDP classifier贝叶斯算法进行分类学分析，在门（Phylum）和属（Genus）分类水平统计各样品的群落组成，利用Mothur软件和R语言工具分别进行多样性分析、物种组成和结构分析等。

1.4 统计分析 试验数据均用SPSS 20.0统计软件进行单因素方差分析（One-Way ANOVA），利用Duncan´s法进行多重比较，显著水平为P＜0.05。数据均以平均值±标准误表示。

2 结果与分析

2.1 不同浓度蜜环菌发酵饲料对洛氏鱥生长指标的影响如表2所示，4组洛氏鱥均无死亡，随着蜜环菌菌液添加量的增加，洛氏鱥的WGR、SGR和CF均呈先升高后降低趋势，FCE则呈先降低后升高趋势，其中6、12、18 mL/kg蜜环菌组CF与0 mL蜜环菌组存在显著差异。6、12 mL/kg蜜环菌组在WGR、SGR、FCE和CF表现较优，然而18 mL/kg蜜环菌组在WGR、SGR和FCE表现最差。

表2 不同浓度蜜环菌发酵饲料对洛氏鱥生长指标的影响

2.2 不同浓度蜜环菌发酵饲料对洛氏鱥免疫和抗氧化指标的影响 由表3可见，洛氏鱥肝脏LZM活性随着蜜环菌菌液添加量的增加而升高，6、12、18 mL/kg蜜环菌组显著高于0 mL/kg蜜环菌组，且3组之间存在显著差异。洛氏鱥肝脏的SOD活性随着蜜环菌菌液添加量的增加而升高，6、12、18 mL/kg蜜环菌组显著高于0 mL/kg蜜环菌组，但6、12 mL/kg蜜环菌组不存在显著差异。洛氏鱥肝脏T-AOC随着蜜环菌菌液添加量的增加而呈先上升后下降的趋势，12 mL/kg蜜环菌组最大，与0 mL/kg蜜环菌组间存在显著差异，但与6、18 mL/kg蜜环菌组无显著差异。

表3 不同浓度蜜环菌发酵饲料对洛氏鱥免疫和抗氧化指标的影响

2.3 不同浓度蜜环菌发酵饲料对洛氏鱥肠道菌群物种组成和结构的影响 由洛氏鱥肠道样品门水平聚类树与柱状图组合分析图可知（图1），6、12 mL/kg蜜环菌组之间群落结构相似度最高，其次18 0 mL/kg蜜环菌组最低。饲喂发酵饲料后洛氏鱥肠道菌群门水平结构发生变化，主要涉及变形菌门（Proteobacteria）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、厚壁菌门（Firmicutes）、放线菌门（Actinobacteria）和梭杆菌门（Fusobacteria）。在0～18 mL/kg蜜环菌组4组洛氏鱥肠道中，变形菌门均占绝对优势，但蜜环菌发酵饲料饲喂使其丰度降低（90.84%～ 73.13%），之后拟杆菌门（2.43%～ 10.11%）和厚壁菌门（2.30%～ 12.78%）丰度增加，放线菌门丰度降低（3.28%～2.18%）。在属的分类水平上（图2），4组洛氏鱥肠道样品共涉及298个属，其中0、6、12、18 mL/kg蜜环菌组分别涉及179、180、210、142个属，鞘氨酸单胞菌属（Sphingomonas）、Caulobacteraceae_uncultured属和固氮螺菌属（Azospirillum）是4组洛氏鱥肠道菌群的优势菌属。与0 mL/kg蜜环菌组相比，6、12、18 mL/kg蜜环菌组饲喂发酵饲料后洛氏鱥肠道菌群属水平结构发生变化，鞘氨酸单胞菌属（39.46%～20.30%）、Caulobacteraceae_uncultured属（17.30%～7.01%）丰度逐渐下降，而固氮螺菌属（4.27%～15.45%）逐渐增大。

3 讨论

3.1 发酵饲料对洛氏鱥生长影响 20世纪60年代初期就有学者将微生物添加到饲料中，发酵后的饲料具有适口性强、消化吸收利用率高等特点[4]，且天然的醇香味具有很好的诱食作用。本试验结果表明，添加蜜环菌发酵的饲料对洛氏鱥的WGR和AGR、FCE以及CE均有利。原因可能是经过发酵后，豆粕中抗营养因子得到有效降解，同时部分大分子蛋白被降解成鱼类可直接消化吸收的小分子蛋白、小肽和氨基酸，饲料的营养价值得以改善，进而提高了动物机体的利用率[5]。

3.2 发酵饲料对洛氏鱥免疫和抗氧化能力的影响 鱼类生活在水中，为特殊生境，因此在抵抗病害方面，与特异性免疫机制相比，非特异性免疫机制更为重要[6]。LZM具有较强抗菌、抑菌功能[7]，破坏病原菌细胞壁[8]，在鱼类启动免疫保护机制时发挥重要作用。SOD普遍存在于细胞浆及线粒体基质中，是一种能清除活性氧自由基的重要抗氧化酶类，能加强免疫能力[9]。T-AOC包括抗氧化酶和非酶促抗氧化2部分，作用主要是消除活性氧自由基避免引发脂质过氧化、分解过氧化物阻断过氧化链和除去起催化作用的金属离子等，是鱼类抗氧化应激的生物标志性指标[10]。肝脏是洛氏鱥的代谢活动中心，免疫和抗氧化能力变化直接关系到整个机体的功能。本试验结果显示，12 mL/kg蜜环菌组发酵饲料可显著提高洛氏鱥肝脏LZM和SOD活性，提高T-AOC，说明蜜环菌发酵饲料对洛氏鱥肝脏的免疫和抗氧化功能起到了积极的调控作用，可刺激机体的非特异性反应，进而提高免疫和抗氧化机能。一方面可能是蜜环菌发酵使基础饲料中的小分子蛋白、肽类和游离氨基酸含量相对较高，增强了机体的非特异性免疫力；另一方面可能是蜜环菌大量繁殖，被利用后增强了机体的体液免疫和细胞免疫机能。

3.3 发酵饲料对洛氏鱥肠道菌群影响 洛氏鱥肠道优势菌群中排前5位的门分别是变形菌门、拟杆菌门、厚壁菌门、放线菌门和梭杆菌门。这5门在异育银鲫[11]、罗非鱼[12]和草鱼[13]的肠道优势菌群中都有不同程度的检出；也是鱼类肠道中主要的好氧、兼性厌氧和专性厌氧菌类群[14-15]。鱼类肠道微生物的构成不仅与宿主的特性密切相关，还与饮食和生活环境的多样性相关[16]，如Ray等[17]和Liu等[18]均利用454焦磷酸测序技术研究罗非鱼肠道菌群，前者结果显示优势菌群为梭杆菌门、拟杆菌门和变形菌门，而后者则显示优势菌群为变形菌门、厚壁菌门、梭杆菌门和放线菌门。变形菌门是细菌中最大的一门，普遍存在于海洋生物肠道之中，是罗非鱼腐败过程中的优势菌门[19]，其含量过高会破坏肠道微生态环境，增加机体患病可能性[20]；在厌氧条件下，某些变形菌与动物形成共生关系，参与环境中的碳和硫循环[21]。拟杆菌门与DNA、蛋白质和脂质等有机物的转换密切相关，并参与糖类、胆汁酸和类固醇代谢[22]。厚壁菌门在宿主肠道中被认为是促进纤维素分解[23]和帮助多糖发酵[24]的重要菌群。放线菌门属于条件致病菌，某些营腐生生活菌可分泌许多胞外酶和次生代谢产物等物质参与自然界氮素循环，而某些放线菌为致病菌，可在机体免疫能力低时侵染机体，产生慢性或亚急性疾病[25-26]。本试验结果显示，12 mL/kg蜜环菌组发酵饲料中变形菌门和放线菌门丰度降低，厚壁菌门和拟杆菌门丰度提高。鞘氨酸单胞菌属微生物能够被动物T细胞识别，使动物免疫力降低，进而感染各种疾病[27]，Caulobacteraceae_uncultured属细菌在无氮环境中丰度较高[28]，而固氮螺菌属细菌则是一类介于自生固氮和共生固氮之间的微生物。本试验结果显示，12 mL/kg蜜环菌组发酵饲料使鞘氨酸单胞菌属和Caulobacteraceae_uncultured属丰度逐渐下降，固氮螺菌属逐渐增大。这表明蜜环菌发酵饲料可以优化肠道菌群丰度，增强对营养物质的转换和吸收，有利于洛氏鱥健康。可能是利用蜜环菌发酵其菌体蛋白质提高了基础饲料生态质量。

4 结论

本试验在基础饲料中添加12 mL/kg蜜环菌菌液，发酵48 h（20℃）制成蜜环菌发酵饲料饲喂效果最好，可提高洛氏鱥生长性能、免疫和抗氧化能力，改变肠道菌群丰度，促进有益菌繁殖，但不改变肠道细菌亲缘关系。因此，进一步研究蜜环菌发酵饲料在水产饲料中的应用十分必要，为新型水产饲料资源的开发提供基础理论依据和参考。