分子印迹技术在药物分析中的应用

2020-08-14李春兰武威职业学院甘肃武威733000

化工管理 2020年22期

李春兰(武威职业学院，甘肃武威 733000)

0 引言

分子印迹技术与人工合成分子识别系统和生物识别系统具有一定的相似性，通过对分子印迹聚合物进行制备，从而可以实现分子键合强度和选择特异性。分子印迹聚合物在药物分离分析、固相萃取等方面得到广泛的应用。

1 分子印迹的原理及方法

分子印迹技术是将目标分子作为模板通过功能匹配的方式，结合共价非共价与模板分子的共同结合，形成单一模板复合物复合物。在交联剂的作用下，可以产生聚合反应，聚合物可以洗去模板分子，与模板分子的空间结构进行结合，形成特异性特征，使分子产生较强的吸附性。

1.1 共价印迹法

模板分子与功能单体从过结合的方式，形成结构非常稳定的分子，但是此类方法制备过程比较复杂，模板分子很难脱离出来。回收利用的环节中，很难达到热力学平衡。

1.2 非共价印迹法

此类方法与共价印迹方法相比，模板分子与功能单体通过氢键和疏水的作用下形成共价键的结合。氢键应用非常多，其合成方法非常简单，操作方式更加灵活。氢键的作用形成比较弱，因此模板分子非常容易清洗与脱落，提升其适用性。然而其结合位点作用强度存在一定的差异，导致非特异性吸附产生。

1.3 准共价印迹法

准共价印迹法是将共价法与非共价法结合起来，通过模板分子与功能单体的结合，形成选择性强的方法，这种方法的适用性非常广泛。

1.4 金属离子印迹法

金属离子印迹法主要采用氧原子和钠原子配位的方式形成电子分子，复合物的稳定性非常高。

2 分子印迹技术在药物分析中的应用

2.1 手性拆分

在手性分子分离技术进行研究中，主要分析消旋体的生物活性。与传统的色谱法比较来说，分子印迹技术可以有效的避免手性固相法价格高昂、容易污染的局限性，而且分子印迹技术的手性流动相选择比较小。

2.2 分子印迹传感器

分子印迹传感器具有非常强的选择性，并且灵敏度高，在药物分析中得到广泛应用。结合模板分子，将邻氨基酚作为功能单体，从而制作印迹膜电化学传感器。

2.3 表面印迹聚合应用

2.3.1 材料

扫描电镜(99.9%)购自远野(上海)有限公司，偶氮二异丁腈(AIBN)。亚甲基琥珀酸是从天津天力化学试剂有限公司获得的。乙烯二甲基丙烯酸酯(EGDMA)、甲基丙烯酸(MAA)、辣根过氧化物酶(HRP)由Sigma Aldrich(美国密苏里州圣路易斯)提供。氯化钾、醋酸钠、醋酸和氢氧化钠均购自国家集团化学试剂公司。

2.3.2 溶剂

磷酸盐缓冲盐(PBS)-0.1M磷酸盐缓冲盐(pH7.4)。

PBS-T-含0.05%吐温-20的PBS缓冲液。

TMB基质溶液-在250μL二甲基亚砜中添加3.3mg TMB到25mL含3.25μL 30%H2O2溶液的柠檬酸磷酸盐缓冲液(pH4.3)中。

1.25M H2SO4溶液。

2.3.3 实验中用到的设备

采用使用扫描电子显微镜(日本东京日立高科技公司)观察MIP的表面形貌。采用傅立叶变换红外光谱法(FTIR)，用多光谱微型板分光光度计(美国加州热科学仪器有限公司)、SHA-B恒温振荡器(上海武友有限公司)测定免疫测定吸光度。

2.3.4 计算模型

利用Gaussian 09软件开发了基于DFT和交换相关函数(M062X)的计算建模方法，用于计算扫描电镜与不同功能单体之间的结合能(ΔE)。分析了SEM与不同功能单体配合物的三维结构、键长和键角。根据公式(1)计算ΔE：

式中：Ec为络合物的能量；Et和Em分别为模板和单体的势能。

2.3.5 溶液体系中模板分子和功能单体的光谱分析

以甲醇-乙腈(1:1，v/v)为溶剂，模板分子SEMs与功能MAA单体的比例分别为1:0、1:2、1:4、1:6和1:8。将混合溶液在恒温水浴中振荡12h，以相应浓度的功能性单体溶液为参考，测定其紫外吸收光谱，并研究其波长位移。

甲醇-乙腈(1:1，v/v)用作溶剂。制备20mM SEM溶液和200mM MAA溶液，按5:2比例混合，以甲醇/乙腈(1:1，v/v)为对照进行FTIR分析和比较。通过分析SEM与MAA键合前后光谱中基团拉伸振动峰的变化，可以判断SEM与MAA键合反应。

2.3.6 MIP膜的制备

MIP的制备环节中，首先，将0.2mmol的扫描电镜和0.8mmol的甲基丙烯酸甲酯分别置于16mL乙腈/甲醇(1:1，v/v)中，37℃磁力搅拌1h，依次加入2.4mmol的EGDMA和20mg的AIBN，37℃磁力搅拌1h，将混合液加入96孔微量滴定板中，200μL/孔，将微量滴定板置于密封的容器中充满氮气的袋子，在37℃下聚合24h。

聚合后，在甲醇-醋酸洗脱液(9:1，v/v)中超声洗脱微量板，每2h更换一次洗脱液，直到不再含有SEM(12h)。然后将微量滴定板在甲醇溶液中洗涤2h以除去醋酸，并在37℃干燥2h。作为对照，NIP(非分子印迹聚合物)的制备与MIP相同，但没有SEM。

用扫描电子显微镜观察MIP和NIP的表面形貌，比较两者的差异，扫描电子显微镜的步骤如下：将样品(100μg)用导电胶带固定在圆柱形支架上，然后在10kV的加速电压下进行真空镀金。在观察之前，样品在10mA下用金溅射30s。观察时间应尽可能短，以避免电子束长期照射造成的电子损伤。

将不同浓度(10～100mg/L)的扫描电镜标准溶液(200μL)加入制备的MIP微量滴定板的每个孔中。在25℃的摇瓶机上以500rpm摇板1h，用HPLC-MS/MS测定SEM浓度，根据吸附前后SEM浓度的变化，计算MIPs对SEM的吸附能力。作为对照，NIP处理与MIP相同。

将扫描电镜溶液(20mg/L)以200μL/孔的速度加入到MIP微量滴定板中。将微量滴定板置于25℃的轨道振动筛上，在25℃下振动(500r/min)不同时间(5、10、20、30、40、50、60、80和100min)。在不同时间，测定溶液中未吸附的扫描电镜的含量。计算了MIP的吸附容量，并绘制了吸附动力学曲线。

吸附容量(Q)按式(2)计算：

式中：Q为吸附量(μg/孔)；C0为SEM的初始浓度(μg/mL)；C为吸附后上清液中SEM的浓度(μg/mL)；V为每孔加入标准溶液的体积(mL)。

2.3.7 酶标抗原的制备

将5mg HRP溶解在1mL去离子水中，然后添加0.2mL 0.1M NaIO4。将混合物在37℃下搅拌20min，滴入0.2mL乙二醇并搅拌30min。在4℃下用1M醋酸钠缓冲液透析过夜后，添加2mL 5mg/mL扫描电镜溶液，并将pH值调整至9.5。然后在黑暗中将混合物搅拌1h，添加0.1mL 4mg/mL NaBH4，在4℃下放置2h，并在0.1M PBS缓冲液(pH=7.4)中透析3d。加入等量的甘油，然后将制剂储存在-20℃下，制备的药物标记抗原浓度为5mg/mL。

先将1g/L的扫描电镜原液稀释至不同浓度(10000、1000、100、10和1ng/mL)。将这些扫描电镜标准溶液加入到MIP微量滴定板(100μL/孔)中，并将1:800稀释比(100μL/孔)的扫描电镜-HRP溶液加入到同一孔中。同时建立对照井和空白井。以1:800稀释比填充100μL PBST和100μL SEM HRP溶液，空白井填充200μL PBST。将微量滴定板放在滚动混合器上2min，在37℃下孵育1h，然后丢弃微量滴定板中的溶液，每3min用PBST清洗5次，并拍打在干净的滤纸上干燥。

将制备好的底物溶液(150μL)添加到每个孔中，并在37℃下孵育30 min。然后将每个孔中的溶液转移到新的微量滴定板的相应孔中，并且通过每个孔添加50μL 1.25M H2SO4溶液来终止反应。然后，在450nm处用多光谱微板分光光度计测定OD值。以SEM浓度为横坐标(x)，按公式计算相应浓度的抑制率，以浓度为纵坐标(y)绘制抑制浓度曲线。

2.3.8 样品制备和方法验证

使用大约2g药品进行均质化，然后，将均匀的样品装入50mL离心管中，分别加入1、10和20μg/kg的扫描电镜溶液，然后加入7.5mL去离子水和0.5mL 1M盐酸。然后将该混合物彻底涡流混合30s，将pH值调整为7.5，涡流混合5min后，加入10mL乙酸乙酯。将混合物置于25℃下20min。然后，将样品在2400g下于25℃下离心10min。收集乙酸乙酯层并在40℃下于氮气流下干燥。用2mL甲醇PBS溶液(1:1，v/v)将残渣重组，在2400g下离心10min。收集下层进行以下BELISA分析。

采用扫描电镜(SEM)标准加入法，对BELISA法的准确度和适用性进行了评价。此外，我们采用传统的ELISA和HPLCMS/MS方法对实际药物样品进行了扫描电镜分析，并与已有方法进行了比较。