周 军，敖宗华，邵 燕，宋 艳，姚 瑶，许 驰

（1.泸州老窖股份有限公司，四川泸州 646000；2.国家固态酿造工程技术研究中心，四川泸州 646000）

白酒和黄酒是中国的国酒，产销量巨大，据中国酒业协会数据显示，2018 年白酒、黄酒产业累计实现销售收入5531.28 亿元[1]。其典型生产工艺是以糯米、高粱、小麦、玉米和大米等单一或多种粮谷为原料，以大曲或小曲为糖化发酵剂，采取“双边发酵”的固态或半固态酿造方式生产。在上述开放式的酿造过程中，自然接种的酵母菌、细菌、真菌、霉菌等多种菌株顺序或协同进行糖代谢、蛋白质代谢及脂质代谢[2-3]，在生成复杂风味物质的同时，也极易代谢产生或由环境迁入多种潜在危害化合物。其中，发酵过程中的氮代谢危害物正受到研究者的普遍关注。

生物胺（Biogenic Amines，BAs）是一类低分子含氮化合物，食品中的生物胺一般是脱羧酶对相应的氨基酸进行微生物脱羧生成的[4]。根据生物胺化学结构的差异，可将其分为3 类：（1）脂肪族生物胺，如腐胺、尸胺和精胺等；（2）芳香族生物胺，如酪胺、苯乙胺和苯丙胺等；（3）杂环族生物胺，如组胺、色胺和吡咯烷等[5]；根据其中胺含量的差异，可将其分为2 类：（1）单胺，如组胺、酪胺和苯乙胺等；（2）多胺，如尸胺、精胺和亚精胺等[6]。低浓度的生物胺对人体有益，是荷尔蒙、生物碱和蛋白质等生物活性物质的合成前体[7]；高浓度的生物胺则对人体有害，如：敏感体质人群对生物胺会发生过敏反应；酪胺的大量摄入会导致头痛、血压变化，并可能导致脑出血、心脏衰竭等不良反应；组胺的大量摄入会导致皮疹、水肿等皮肤疾病，亦可导致呕吐、腹痛等肠胃不适和头痛、呼吸困难和低血压反应等不良反应[8]。

腐胺、尸胺、精胺、亚精胺、酪胺、苯乙胺、组胺和色胺等8 种生物胺在调味品、发酵香肠、葡萄酒、奶酪、肉制品和水产品等食品中被广泛检出[7]。一些国家和地区已对不同食品中生物胺（以对组胺的限量为主）的含量规定了限量标准。我国规定鲐鱼等高组胺水产品及其他海水鱼类中组胺的最高限量分别为400 mg/kg 和200 mg/kg；欧盟规定鲜鱼及发酵鱼中组胺的最高限量分别为200 mg/kg和400 mg/kg，其他食品中组胺最大限量为100～200 mg/kg；美国规定水产品中组胺及酪胺最高限量分别为50 mg/kg 和100 mg/kg，其他食品中组胺的最高限量为50 mg/kg[9]；新西兰和澳大利亚规定水产品中组胺最大限量为200 mg/kg[10]。含乙醇的酒精性饮料，由于乙醇对胺氧化酶活性的抑制作用，可显著增强酒类制品中生物胺的生理毒性，因此，理论上生物胺的限量标准应设置得更低。目前，已有多个国家对葡萄酒中的组胺最高限量设定了标准，如，瑞士和澳大利亚的最高限量标准为10 mg/L，法国的最高限量标准为8 mg/L，荷兰的最高限量标准为3.5 mg/L，德国的最高限量标准为2 mg/L[7]。

市售黄酒、白酒的酒精度一般在14 %vol～20%vol 和35%vol～60%vol 之间，均高于葡萄酒，但我国至今尚未建立上述传统酒中生物胺含量的限量标准。因此，本文综述了白酒和黄酒中生物胺的前处理方法、检测手段、控制措施，并展望了研究中存在的问题及未来的潜在研究热点，以期为相关标准的建立和政府监管部门的决策提供基础数据和科学依据。

1 生物胺检测

1.1 样品前处理方法

生物胺的结构多样，且在白酒、黄酒等复杂基质中的浓度较低。因此，高效准确前处理方法的建立，不仅可除去可能干扰色谱分析的其他化合物进而提高目标分析物的响应信号，更是高通量检测的基础。

针对白酒、黄酒中生物胺的前处理方法早期以直接进样为主，目前以液液萃取（LLE）为主，其萃取原理是基于各类化合物在不同极性溶剂中的溶解度差异而分离，常用的萃取溶剂为甲苯、氯仿、二氯甲烷等极性较强的有机溶剂[11]。2006 年，陆永梅等[12]首次对黄酒中生物胺进行定量检测，采用直接取样，衍生化后经高效液相色谱定量；2013年，范文来等[13]参考Ough 等的方法并进行优化，首次对白酒中生物胺的分布进行了定性检测，前处理方法为液液萃取，萃取剂为二氯甲烷和丁醇，检测仪器是气相色谱-质谱联用仪。

但传统液液萃取（LLE）方法具有操作复杂、有机溶剂消耗量大、后富集时间长的缺点，一些基于LLE 的微萃取方法如：液相微萃取（LPME）[14]、基于悬浮溶剂固化的分散液液微萃取（DLLMESFO）[15]、涡旋辅助-表面活性剂-液液微萃取（VSLLME）[16]和盐析辅助液液萃取（SALLE）[17]等正越来越广泛应用到食品中生物胺的快速萃取。2009 年，Saaid 等[14]建立了以液相微萃取为前处理方法，结合高效液相色谱-紫外法对虾酱和番茄酱中5 种生物胺的高效检测；2013 年，Jia 等[15]建立了以悬浮溶剂固化的分散液液微萃取技术（DLLMESFO）为前处理方法，结合液相色谱-紫外法对白葡萄酒、红葡萄酒、米酒、啤酒中9 种生物胺含量的快速测定方法；2014 年，Donthuan 等[16]应用涡旋辅助-表面活性剂-液液微萃取（VSLLME）为前处理方法，结合高效液相色谱法对发酵鱼类、葡萄酒、啤酒中的生物胺进行了准确测定；2015 年，Jain 等[18]在传统LLE 基础上，以硫酸铵进行盐析，建立了以盐析辅助液液萃取技术为前处理方法，结合高效液相色谱法对果汁、酒精饮料中的生物胺含量快速测定的方法，该方法在减少了萃取剂用量的同时，降低了副产物的含量。

近年来，基于固相萃取技术（SPE）的前处理方法也开始应用到食品中生物胺的检测，与上述基于LLE 方法萃取原理不同，SPE 原理是根据样品中不同组分对溶剂和吸附剂的亲和力差异而分离[19]。Zhang 等[20]建立了以Oasis MCX 固相萃取小柱为吸附材料，洗脱、富集、衍生化、经高效液相色谱法检测对黄酒中7 种生物胺的准确定量方法。但SPE萃取、脱附和富集过程中，需要复杂的梯度洗脱及样品浓缩过程，为此，基于SPE 的改性新技术，如固相微萃取技术（SPME）、分子印迹固相萃取（MISPE）、气体扩散微萃取（GDME）和基质辅助固相分散萃取（MSPD）等前处理手段被用于果汁、葡萄酒、金枪鱼等食品中生物胺的检测[21-23]。Self 等[23]建立了以MSPD 为样品前处理手段，结合高效液相色谱法对金枪鱼中生物胺进行快速、准确测定的方法，MSPD 由于其简便、高效的萃取能力，在食品、药品的生物胺快速检测中展现出良好的发展潜力。

上述新的前处理方法普遍具有绿色、高效、准确的优点，在白酒、黄酒生物胺的日常检测和企业质控中表现出巨大的潜在应用价值。

1.2 生物胺的检测方法

目前，针对食品中的生物胺的检测方法主要有：高效液相色谱法、气相色谱法，薄层色谱法、离子色谱法、毛细管电泳法和酶联免疫吸附法等。

1.2.1 高效液相色谱法

生物胺的沸点相对较高、高温不太稳定，因此，高效液相色谱法是食品中生物胺检测的最常用方法。研究早期多采用紫外或荧光与高效液相色谱联用，但生物胺化学结构缺乏特征发色官能团，因此，必须进行衍生化处理，图1 所示是衍生化反应的典型反应方程式，其机理是活泼氢的亲核取代反应[24]，衍生化试剂主要是：邻苯二甲醛（OPA）、丹磺酰氯（DNS-Cl）、苯甲酰氯（BzCl）。

在上述衍生化反应中，DNS-Cl 和BzCl 与生物胺的衍生物相对比较稳定，但此两种衍生化试剂均为非特异性试剂，可与食品中其他基质如酚类、脂肪醇的活泼氢反应，因此，对样品的前处理要求较高；OPA 只能与初级生物胺发生衍生化反应，且衍生物稳定性相对较差，因此，常与2-巯基乙醇一起使用[25]。由于紫外或荧光检测器均需要上述复杂的衍生化过程，因此，高效液相色谱与质谱联用技术在食品中生物胺的检测越来越受到研究者的关注，该技术在避免衍生化的同时，还可以提供丰富的物质结构信息。Sirocchi 等[26]建立了HPLC-MS/MS 方法对肉中10 种未经衍生化生物胺的直接测定方法。随着质谱技术的进步，飞行时间质谱法、四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱法等也被用于复杂基质中生物胺的检测[27-28]。

1.2.2 气相色谱法

气相色谱法不能检测挥发性较弱或热不稳定化合物，在对食品中生物胺检测时需要衍生化以降低化合物极性，提高挥发性，以改善化合物在色谱柱中的驻留，因此，气相色谱法在生物胺的检测中有一定天然劣势。Awan 等[29]建立了固相微萃取纤维头衍生化结合气质联用仪对肉类、蔬菜及奶酪中的腐胺及尸胺检测的方法，该方法直接在蒸汽状态下于萃取头上衍化，大幅简化了操作流程，提高了检测效率。

1.2.3 薄层色谱法

薄层色谱法不依托昂贵的仪器，具有批处理样品量大、检测快速和易于操作的优势，对图像采集和分析系统的改进，薄层色谱法克服了以往仅能定性不能定量的弱点。Romano 等[30]建立了薄层色谱法对葡萄酒中的生物胺检测的方法，其借助不同浓度标准品和待测样品在254 nm 紫外灯照射下的荧光强度，经图像处理软件转化为数字化浓度，实现了对葡萄酒中生物胺的快速定量。

1.2.4 离子色谱法

离子色谱法是基于离子交换能力或组分选择性系数的差异达到分离的目的，生物胺具有阳离子性质，无需衍生化适合离子色谱分离。Palermo等[34]依托多线性梯度洗脱、甲基磺酸和弱离子交换柱的使用，建立了离子色谱法对凤尾鱼、奶酪、葡萄酒和意大利腊肠中8种生物胺的检测方法。

1.2.5 毛细管电泳法

毛细管电泳原理是基于样品中不同组分在高压电场和毛细管作用下的迁移率和分布特征不同以达到分离的目的。Cortacero 等[35]建立了离子色谱结合激光诱导/荧光检测器对啤酒及其发酵过程中10种生物胺的准确检测方法。

1.2.6 酶联免疫吸附法

酶联免疫吸附法的原理是基于抗原抗体之间的免疫反应，由于抗原或抗体标记的酶可以催化并放大底物反应，因此该方法的灵敏度较高，但价格较昂贵。具体实验过程是用生物胺免疫实验动物以制备特异性单克隆抗体，用该抗体检测食品中生物胺含量。Marcobal 等[31]建立了酶联免疫吸附法对61 种产自西班牙不同地区葡萄酒中生物胺的含量测定方法，组胺、酪胺和苯乙胺的含量均低于研究者预期，且生物胺含量与葡萄酒陈酿时间不相关。

1.3 白酒中生物胺检测进展

目前，针对白酒中生物胺的研究尚不够系统，尚未见对白酒中生物胺整体含量的权威性报道。与白酒相关的生物胺报道最早可追溯至2012年。

2012 年，杜木英等[32]建立了氨基酸自动分析仪结合液相色谱对青稞酒酿造过程中7 种生物胺含量的追踪方法。结果表明，发酵过程中生物胺总量变化不显著，随发酵的进行新生成了组胺；组胺和酪胺随发酵时间延长含量上升，腐胺及胍丁胺随发酵过程含量下降，尸胺、精胺、亚精胺含量变化不明显。

2013 年，温永柱[13]等建立了LLE 结合气相色谱-串联质谱联用方法，首次在中国白酒中定性鉴定出：尸胺、腐胺、甲胺、乙胺、环戊胺、异戊胺、环己胺、环庚胺、吡咯烷等9种生物胺。

2013 年，温永柱等[33]借助LLE 结合高效液相色谱-紫外检测器，对白酒中5 种生物胺的含量进行了检测。

2015 年，范文来等[34]建立了液液微萃取(LLME)结合高效液相色谱法检测酒醅发酵及蒸馏过程中5 种生物胺的含量变化规律。结果表明，除尸胺是随着发酵时间一直上升外，其他4 种生物胺均呈现先上升，再缓慢下降的规律；与其他饮料酒相比，白酒中的生物胺含量最低。

2017 年，王春利等[35]建立了液液微萃取(LLME)结合高效液相色谱法对白酒中8 种生物胺的快速检测方法，衍生化试剂选择的是丹磺酰氯，对随机抽取的5 种市售酱香型白酒的检测结果显示，色胺是主要生物胺，酪胺含量较低，其余6 种生物胺均未检出。

综上所述，对于白酒中生物胺的富集方法主要是液液萃取和液液微萃取。液液萃取由于溶剂消耗量大、操作复杂、耗时长等缺点，被液液微萃取逐步取代；高效液相色谱仪仍是目前检测白酒中生物胺的主要仪器，但其复杂、耗时的衍生化过程成为制约快速检测的决定性因素。

1.4 黄酒中生物胺检测进展

针对黄酒中生物胺检测的研究要早于白酒的研究，目前建立的主要检测方法为：高效液相色谱法、离子对液相色谱法、薄层色谱法等。

2006 年，陆永梅等[12]首次采用丹磺酰氯为衍生化试剂，建立了高效液相色谱法对黄酒中的5 种生物胺（组胺、酪胺、尸胺、亚精胺、精胺）的检测方法。

2012 年，玉澜等[36]应用室温离子液体为前处理手段，经丹磺酰氯衍生，结合高效液相色谱仪建立了对黄酒中6 种生物胺（酪胺、尸胺、精胺、腐胺、苯乙胺、色胺）的准确检测方法。

2014 年，彭祺等[37]建立了高效液相色谱串联三重四级杆质谱法对黄酒中主要的8 种生物胺的检测方法，该方法无需进行衍生化处理，显著缩短了样品前处理时间，适合黄酒的批量检测。

2014 年，华永有等[38]建立了高效液相色谱-荧光检测法(HPLC-FLD)同时检测黄酒中的9种生物胺的方法。根据峰面积比较，荧光比紫外检测的灵敏度高一个数量级，本法操作简便、准确可靠。

2016 年，曹利瑞等[39]建立了一种三氯乙酸提取，丹磺酰氯柱前衍生化，高效液相色谱-紫外检测器对黄酒中9 种生物胺含量测定的方法。结果显示，在5 种黄酒样品中，总生物胺含量的范围在6.741～161.48 mg/L 之间；均未检测出盐酸吡哆胺；8种生物胺的含量差别明显。

2017 年，杜赛等[40]建立了柱后衍生-离子对液相色谱法对发酵酒中8 种主要生物胺的检测方法，该方法数据准确、方法简便，适合日常批量分析检测。

2017 年，李燕君等[41]建立了一种改进的薄层色谱法检测不同发酵阶段及不同年份黄酒中生物胺含量的方法，结果显示，该方法适合6 种生物胺（组胺、酪胺、尸胺、亚精胺、精胺、腐胺）的定性、定量分析，且该方法操作简便、费用低，可同时检测多个样品。

2018 年，冷宜昕等[42]建立了激光解吸/激光后电离质谱法快速检测黄酒中的酪胺，该方法无需样品前处理，可直接用于黄酒样品的快速分析，且谱图简单清晰，信噪比高，适用于黄酒中酪胺含量的快速检测。

黄酒中生物胺检测方法主要是液相色谱法，通常需要衍生化之后，结合紫外或者荧光检测器检测。黄酒由于酿造原料中氨基酸含量丰富，且其属于非蒸馏酒，因此，黄酒中生物胺含量相对较高。张敬等[43]对3 种不同发酵酒中生物胺含量进行测定，结果显示，黄酒、葡萄酒、啤酒的平均含量分别为78.304 mg/L、11.240 mg/L 和4.787 mg/L，黄酒中生物胺含量最高。温永柱等[33]的研究结果揭示，无论在清香型、浓香型或酱香型成品白酒中，生物胺平均含量均低于2 mg/L。

2 控制措施

目前，针对白酒、黄酒中生物胺的定向消减或调控机制的研究尚不够系统，借鉴其他食品中生物胺的来源分析及控制措施，普遍认为可从如下三方面进行调控：从源头处调控、加工贮存中调控、产生后消减其含量。

2.1 从源头处调控

生物胺的微生物代谢底物多为原料中含氮物质，其中，蛋白质和氨基酸是其主要代谢底物，因此，在不影响产品质量基础上，建议使用蛋白质/氨基酸含量略低的原料，以减少最终产物中生物胺的积累[44-45]。此外，发酵过程中的选用菌株以无或少氨基酸脱羧酶活性的菌株代替原有菌株，进而减少微生物代谢的积累，但白酒、黄酒自然接种的发酵方式和开放式生产，很难对菌种进行定向选育。

2.2 生产过程中调控

对实际生产过程人为调控，会显著减少最终产品中生物胺的含量。如：黄酒生产过程生物酸化浸米技术的应用；白酒生产中缩短与窖泥接触时间；发酵完成，及时终止代谢反应[46]。此外，还可以将一些在葡萄酒和奶酪发酵过程中发现的具有降解生物胺的菌株，应用到白酒和黄酒生产中。Joosten等[47]证实将产细菌素和产乳酸链球菌素的菌株添加到奶酪生产过程中，有效的抑制了产生物胺菌株的生长，显著降低了产品中生物胺含量。Garcia-Ruiz 等[48]发现，从葡萄酒酿造微生物中筛选出的乳酸菌、片球菌属的9 株菌株对生物胺表现出较强的降解能力，其中编号为L.caseiIFI-CA 52 的菌株生物胺降解能力最强。因此，筛选或培育出适合白酒、黄酒中生物胺降解的有效菌株是未来研究的重要方向。

2.3 产生后消减

白酒、黄酒基酒生产后均需要较长的陈酿过程，此过程中生物胺的含量也存在动态变化。何晨怡等[49]发现在25 ℃和37 ℃条件下，随贮藏时间的延长，黄酒中尸胺的含量呈下降趋势，组胺含量变化不显著，酪胺含量呈上升趋势。栾同青等[50]发现将同一批次黄酒分别贮存在4 ℃、20 ℃和37 ℃条件下，其组胺、酪胺和腐胺的含量与时间呈负相关，即低温、短贮藏时间有利于生物胺含量的消减。但上述研究尚不够系统，上述结论均需进一步的文献支持。

3 总结与展望

白酒、黄酒作为最具中国本土化特色的传统发酵酒，近年来一直在追寻“风味、健康双导向”的发展理念，安全性是健康的基础。本文综述了两种传统酒中生物胺的前处理方法、检测手段、控制措施，特别是针对检测的历史沿革、新的技术手段和潜在的消减策略做了系统论述，对我国传统蒸馏酒的技术升级、政府监管部门的标准制定和未来相关领域的发展方向提供了基础的数据支撑。