陈 涛，李加友，陆筑凤，沈 洁

（1.宿迁市产品质量监督检验所，江苏宿迁 223800；2.嘉兴学院生物与化学工程学院，浙江嘉兴 314001）

蜂蜜的主要组成成分是果糖和葡萄糖，还富含有机酸、维生素、蛋白质等营养物质[1]。蜂蜜酒是以蜂蜜为原料酿造而成的酒精饮料，由于酵母菌的代谢作用，蜂蜜酒的营养价值超过了蜂蜜。蜂蜜酒能使人皮肤红润，延缓衰老，增强抵抗力，可以缓解失眠健忘、精神不振，对肠胃慢性疾病、哮喘和支气管炎等疾病有良好作用[2]。

桂花是我国十大传统花卉之一，有悠久的食用历史，干燥后的桂花可用于泡茶、浸酒、制作药膳和各类糕点等[5-6]。桂花具有健脾开胃，化痰生津，解除疲劳的功效，更能治疗食欲不振，痰多咳嗽，闭经腹痛[7]。桂花富含极多对人体有益的生物活性物质，特别是桂花总黄酮，有抗自由基和防癌抗癌的作用[8]。

油菜花蜜产量大，是常用的蜂蜜酒酿造原料，但是蜜香的半衰期短，陈酿后的蜂蜜酒香气不足；在蜂蜜酒酿造过程中加入桂花，使产品兼具桂花和蜂蜜酒的双重优点，不仅满足了人们对时尚饮酒的需求，还有良好的保健作用，具有重要的研究价值和广阔的市场前景。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂及仪器

材料：桂花（干品，浙江艺福堂茶业有限公司），油菜花蜜（兴宏丰达食品贸易有限公司），黄酒酵母（安琪酵母股份有限公司）。

耗材及试剂：0.1 mol/L 氢氧化钠标准溶液，1 %酚酞乙醇溶液，碱性酒石酸铜甲液，碱性酒石酸铜乙液，219 g/L 乙酸锌溶液，106 g/L 亚铁氰化钾溶液，40 g/L氢氧化钠溶液，盐酸溶液（1+1），1 g/L葡萄糖标准溶液。

仪器设备：水浴锅，恒温培养箱，电子天平，酸式滴定管，光学显微镜，血细胞计数板，比重计，顶空瓶，气相色谱-质谱联用仪（Agilent 7890-5975A），HP-5MS石英毛细管色谱柱（30 m×0.25 mm，0.25µm），65µm PDMS/DVB 萃取头、75µm CAR/PDMS 萃取头、85µm PA 萃取头。

1.2 试验方法

1.2.1 桂花蜂蜜酒的酿制

将蜂蜜水的含糖量调整至21 %，以食品级柠檬酸调节pH3.3；将调好的蜂蜜水加热至80 ℃，并保持30 min；自然降温至38 ℃时，加入活化好的酵母。然后于25 ℃条件下恒温培养。7 d 后在发酵罐中分别添加0、0.5‰、1‰、1.5‰和2‰（w/v）的干桂花，每组5 瓶。

1.2.2 酒精浓度的测定

参照国标法GB/T 15038—2006 葡萄酒、果酒通用分析方法测定，采用酒精计法。

1.2.3 酵母数量的测定

血球计数板法。

1.2.4 还原糖含量的测定

（1）取100 mL 的待测酒液，用氢氧化钠调节pH 值至中性，转移至容量瓶中，加入5 mL 乙酸锌溶液和5 mL 亚铁氰化钾溶液，以去离子水定容至250 mL。

（2）碱性酒石酸铜溶液的标定：吸取5 mL 碱性酒石酸铜甲液和5 mL 碱性酒石酸铜乙液，置于洁净的锥形瓶中，加入去离子水10 mL，放入玻璃珠2粒，加热至沸腾，趁热以标准还原糖溶液滴定，滴定终点为溶液蓝色刚好褪去，且30 s 后颜色不恢复。

（3）待测酒液还原糖的测定：吸取5 mL 碱性酒石酸铜甲液和5 mL 碱性酒石酸铜乙液于洁净的锥形瓶中，加入去离子水10 mL，放入2 粒玻璃珠，加热至沸腾，趁热用处理后的酒液滴定，滴定终点为溶液蓝色刚好褪去，且30 s 后颜色不恢复。

1.2.5 总酸的测定

参照国标法GB/T 15038—2006 葡萄酒、果酒通用分析方法测定。

1.2.6 桂花蜂蜜酒中挥发性成分检测

取15 mL 酒液于洁净的顶空瓶中，放入40 ℃水浴锅中加热，让香气成分挥发，充满整个顶空瓶，再将老化完毕的固相萃取装置固定在顶空瓶上端，推出针头，保持针头在顶空瓶内部且不接触酒液，保持30 min。

吸附完毕后，用GC-MS 检测其挥发性组分。检测条件如下：

气相色谱条件：进样方式采用手动进样；色谱柱为HP-5MS 石英毛细管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；升温程序如下：初始温度50 ℃，保持5 min 后，以3 ℃/min升温至125 ℃，保持5 min，然后以2 ℃/min升温至180 ℃，保持3 min，最后以5 ℃/min 升温至250 ℃，总运行时间为79.5 min；载气：高纯气（≥99.999 %），流速1.0 mL/min；进样口温度250 ℃；进样模式为无分流进样。

质谱条件：离子源为EI 源，电子能量70 eV；接口温度为280 ℃；离子源温度为230 ℃；四极杆温度为150 ℃；发射电流为34.6 A；扫描方式：全扫描；质量扫描范围：35～450 aum；溶剂延迟时间：3 min。

在质谱仪的NIST 谱库中进行定性分析，以接近度最高的结构为鉴定结果。

2 结果与分析

2.1 桂花对蜂蜜酒酿造过程和产品品质的影响

酿造就是酵母生长和代谢的过程控制，考察酵母生长情况，是掌握酿造过程变化的基础，可以为过程控制提供直接依据。从不同桂花添加量的蜂蜜酒酿造过程中酵母数量的变化来看（见图1），前期的区别并不明显。15 d 以后的检测结果表明，随着桂花添加量的增加，单位体积中酵母数量明显减少；桂花添加量为0.2%时，17 d 时酵母数量比对照减少了50%。同时进行的还原糖检测结果表明（见图2），桂花添加量多时，起始阶段的还原糖消耗速度慢，但是经过陈酿后的还原糖含量无明显差异；进一步的酒精浓度测定结果表明，虽然起始阶段的酒精浓度和酵母数量有正相关性，但是最终酒精浓度的差别并不明显，分别为10.76%vol、10.66%vol、10.53%vol、10.50%vol、10.43%vol（见表1）。

另一方面，总酸的检测结果表明（见表1），桂花的添加对酒液的总酸产生了影响，随着桂花添加量的增多，酒液的酸度下降。因此，桂花添加对酵母生长产生影响的可能原因是：在酿造起始阶段，由于桂花浸出物少，酵母生长的差异并不明显；随着时间的变化，桂花浸出物越来越多，部分浸出物可能对酵母生长具有一定的抑制作用；同时增大了酒液酸度，影响了酵母生长，从酵母生长的过程检测来看，表现出明显的差异性。但是，随着酿造过程的进行，尤其长时间的陈酿，最终产品中残糖和酒精浓度并无明显差别。

表1 桂花添加量对酒精浓度和总酸的影响

2.2 香味物质检测结果

利用GC-MS 对桂花蜂蜜酒和对照的挥发性成分进行检测（表2），在桂花蜂蜜酒中共检测出32种化合物，其中醚类化合物2 种，醇类化合物2 种，酯类化合物12 种，羧酸类化合物6 种，杂环类化合物4 种，烯烃类化合物4 种，含氮有机物2 种；在蜂蜜酒原液中共检测出31 种化合物，其中醚类化合物1 种，醇类化合物4 种，酯类化合物11 种，苯酚类化合物4 种，羧酸类化合物3 种，杂环类化合物7 种。

酿造出的桂花蜂蜜酒中，香气成分主要为酯类物质和醇类物质，其中酯类物质如苯丙酸乙酯，乙酸戊酯，乙酸-3-甲基丁酯，1-癸烯酸乙酯等都是在添加桂花后产生的[9]，这些香气成分的产生可能是添加桂花后浸泡产生的，其产生机理有待更进一步研究，也有如组氨酸-2-油酸-N-苯甲酰基二乙基酯，苯甲酸乙酯，琥珀酰二乙酯，辛酸乙酯，癸酸乙酯等都是两者共有的，癸酸乙酯具有椰子的香气味，乙酸戊酯则是具有令人愉悦的花香味[10]，苯甲酸乙酯稍带有水果味，琥珀酸二乙酯带有令人舒适的葡萄气味[11]，辛酸乙酯带有白兰地酒香味，己酸乙酯带有曲香和菠萝香味，但是也有原蜂蜜酒有的而桂花蜂蜜酒中未检测出的如[2，6-二乙基苯基]氨基甲酸甲酯，2-壬基环丙烷十三烷酸甲酯，甲酸-3-甲基-1-丁酯等酯，因为3-甲基-1-丁醇在两者中都有检测出，但桂花蜂蜜酒中没有，分析原因为桂花中有机成分与甲酸反应更加剧烈[12]，故没有在桂花蜂蜜酒中检测出，两种酒共检测出4种醇，这4 种醇在蜂蜜酒原液中都能检测到，但是在桂花蜂蜜酒中只检测出了两种，1-癸基磺酰基d-甘露醇，2-甲基十六烷醇都未检测出，并且未检测出与之相关的长链酯，其原因有待进一步研究。以上化合物都对桂花蜜酒的独特香气味起着重要作用。

此外，许多在蜂蜜酒中检测出的苯酚类化合物如2，6-双（1，1-二甲基乙基）-1，4-苯二酚等并没有在桂花蜂蜜酒中检测出，但是桂花蜂蜜酒中检测出了带有相应结构的杂环苯类化合物如1，2，4-benzenetri carboxylic acid，1，2-dimethyl ester 等，且这些化合物原蜂蜜酒中并无，所以桂花蜂蜜酒中的一些杂环苯类化合物是由蜂蜜酒中的一些苯酚类化合物反应而来。

然而，像二氢-β-紫罗兰酮，β-紫罗兰酮，α-紫罗兰酮等这些桂花特征香气的主要组成成分在桂花蜂蜜酒中均未检测出，原因是在检测桂花蜂蜜酒时并未使用二氯甲烷萃取并富集香气成分，且检测方法和仪器相对有所局限性，如甲酸乙酯、甲醇等低沸点成分也未检测出[13]，因为萃取所用的顶空瓶在萃取时并未密封，导致未能采集到这些物质，所以未能检测到。

3 结论

在蜂蜜酒酿造过程中添加桂花作为增香物质，随着桂花添加量的增多，酵母菌的生长会受到一定程度的抑制，总酸含量明显增加，但对成品酒的酒精度和残糖影响并不明显。然而，桂花的添加对蜂蜜酒的香气成分产生了显著的影响，桂花蜂蜜酒比对照增加了20 种挥发性成分，如乙酸戊酯、苯丙酸乙酯等，它们构成了桂花蜜酒的独特香味。因此，在蜂蜜酒酿造时添加桂花增加香气味，可以显著提高产品品质，是一种值得推广的新方法。