潘建波

（广西柳州市动物疫病预防控制中心 545001）

猪蓝耳病毒可导致妊娠母猪繁殖障碍及呼吸道症状，是一种高传染性、高死亡率的动物疾病。该病最早发生在美国，荷兰于1991 年分离出该病毒，1996 年在我国首次报道，给我国养猪业造成巨大的经济损失[1]。该病的临床症状一般以食欲下降，耳部、腹部皮肤发绀、高热、喘气为主要症状，经常会伴有其他疾病混合感染。本研究从临床送检的病料中分离鉴定了一株猪蓝耳病毒，旨在为后续猪蓝耳病毒病的流行病学调查及新型防控技术的研究奠定物质基础。

1 材料和方法

1.1 材料

Vero 细胞购于上海盖宁生物科技有限公司；源于参考文献[2]的猪蓝耳病毒经典毒（418bp）、变异病毒（508bp）区分扩增引物PRRSV-F：5’ -TGGGCGACAATGTCCC-3’，PRRSVR：5’ -GCTGAGTATTTTGGGCG-3’ 合成于上海生物工程有限公司；一步法RT-PCR 试剂盒（R055A)、DNA 分子量标准DL2000 购于大连宝生物工程有限公司；RNA/DNA 核酸共提取试剂盒购于杭州博日工程有限公司；细胞培养液DMEM、小牛血清、核酸燃料、细胞培养瓶等均为本单位保存。

1.2 病料样品的处理

取广西柳州市某发病猪场送检的组织病料加入3～5 倍体积的灭菌生理磷酸盐缓冲溶液（PBS）充分研磨，冻融2 次，10000rpm 离心5min，取上清液经0.45μm 滤膜过滤，加入青霉素（工作浓度100IU/ml）、链霉素（工作终浓度100ug/ml) 于4℃作用6h 后，-20℃保存备用。

1.3 病毒的分离

将1.2 处理的样品接种于已长成单层的Vero 细胞的培养瓶中，0.5ml/瓶，摇匀后置于37℃吸附1h，然后加入含3%胎牛血清的DMEM 维持液。培养观察3d，每日观察，72h 后无病变的进行盲传。

1.4 RT-PCR 检测

取有细胞病变的细胞培养瓶，冻融一次，10000rpm 离心5min，取上清进行总核酸提取。以获得的总核酸为模板进行RT-PCR 扩增。反应体系25μl：2×One-Step 反应buffer 12.5μl，酶混合液1μl，上、下游引物各1μl（浓度10uM），核酸模板2μl，用无菌水补至25μl。扩增程序：50℃反转录15min，94℃变性3min；94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸30s，30 个循环；72℃延伸6min。

2 结果与分析

（1）将病料接种Vero 细胞后传至第2 代时，在48h 后出现细胞折光率增强，细胞圆缩，随后细胞溶解脱落等细胞病变（如图1 所示），毒价测定结果显示，该细胞毒的毒价为104.5TCID50/0.1ml。

（2）RT-PCR 检测结果

取8uL RT-PCR 产物，经过1%琼脂糖凝胶电泳检测，在约508bp 的位置出现目的条带（见图2），表明所检测的样本中含有猪蓝耳病毒变异株的核酸物质。

3 讨论

随着我国养猪模式的不断改变，规模化、集约化养殖场不断增多，呼吸道相关疾病越来越受到关注，猪蓝耳病毒可以造成各年龄段猪群感染发病，导致免疫力降低，从而导致猪瘟、链球菌疾病的发生，同时也影响疫苗免疫效果，给我国养猪业造成巨大经济损失[3]。疫苗免疫是预防疾病发生的有效手段之一，为了更好地研制适合于流行毒株的新型疫苗，需要不断对流行毒株进行分离鉴定，本次成功分离鉴定了一株蓝耳病毒，可为后续新型疫苗研制及流行病学的调查提供物质基础和数据支持。