段海婧 ，马 骏 △

（1.甘肃中医药大学药学院，甘肃 兰州 730000；2.甘肃省中药药理与毒理学重点实验室，甘肃 兰州 730000）

白血病(leukemia)是一类造血干细胞的恶性克隆性疾病，其克隆中的白血病细胞增殖失控，分化障碍，凋亡受阻，停止在细胞发育的不同阶段。在骨髓和其他造血组织中白血病细胞大量增生累积，并浸润其他组织和器官，使正常造血受到抑制。白血病是中国十大高发恶性肿瘤之一，在恶性肿瘤病死率中，其居第6位（男性）和第8位（女性），在儿童及35岁以下成人中则居第1位，在我国急性白血病发病率较高[1]。目前，白血病的治疗仍以化疗为主，但是因为大多数化疗药物十分昂贵且不具备靶向治疗的特点，部分在治疗白血病的同时还会产生严重的毒副反应。一些病人因为耐受不了药物的毒副作用或因经济原因而放弃治疗。随着人们对生存质量的重视，既有抗肿瘤作用，毒副作用又小且价格低廉的治疗白血病的药物，越来越受到人们的青睐。

天蓝苜蓿，别名接筋草，以全草入药，生于郊野旷地和路边、田埂草丛中，多分布于东北、华北、西北、华中和西南各地。性甘、微涩，平，具有清热利湿，凉血止血，舒筋活络等功效。民间主要用于白血病，黄疸型肝炎，便血，痔疮出血，坐骨神经痛；风湿骨痛，腰肌劳损等[2]。夏小军的复方回生胶囊（天蓝苜蓿、墓头回等）在临床用于治疗小儿急性白血病具有显著疗效[3]，其中的主药天蓝苜蓿和墓头回经体外药敏试验，具有抗急性白血病细胞的作用[4]。但有关天蓝苜蓿抗急性白血病的药理作用研究未见文献报道。本文通过MTT法研究不同浓度的天蓝苜蓿含药血清对K562细胞增殖抑制的影响。

1 仪器与试药

1.1 仪器

80-1型离心机 (金坛市恒丰仪器厂)；YZG/FZG系列真空干燥机 (杭州钱江干燥设备有限公司)；MCO-15AC培养箱(日本SANYOElectric Biomedical Co., Ltd.)；安全柜；BIOZYMEⅢ酶标仪(美国BIO RAD 公司)。

1.2 试剂

胎牛血清（浙江天杭生物科技股份有限公司）；青链霉素 (武汉普诺赛生命科技有限公司)；1640培养基(赛默飞世尔科技有限公司)；MTT（Fluka公司）：二甲基亚砜(DMSO)。

1.3 药材

天蓝苜蓿于2015年7月采自甘肃省平凉市崆峒区，由甘肃中医药大学药学院中药鉴定教研室杨扶德教授鉴定为豆科苜蓿属天蓝苜蓿(MedicagolupulinaL.)地上部分。

1.4 动物和细胞

小鼠100只，体重20±2g，由甘肃中医药大学动物实验中心提供；K562细胞，购自上海瓦兰生物有限公司

2 方法

2.1 天蓝苜蓿水煎液提取及配制

取天蓝苜蓿地上部分干燥、粉碎。取药物1000g，加 5000mL水煮沸 1h,去渣取汁，得水煎液3000mL，将残渣加水5000mL煎煮45min，去渣取汁，得水煎液4100mL,合并两次水煎液，过滤浓缩，置于4℃冰箱保存，备用。

配制高剂量，给药时用蒸馏水调整浓度为1g/mL，为高剂量。

配制中浓度(0.5g/mL)天蓝苜蓿100ml，量取高浓度(1.0g/mL)天蓝苜蓿煎膏液50mL，准确用蒸馏水稀释至100mL得到中浓度(0.5g/mL)天蓝苜蓿煎膏液。量取中浓度(0.5g/mL)天蓝苜蓿煎膏液40mL，用蒸馏水稀释至80mL，得到低浓度(0.25g/mL)天蓝苜蓿。

2.2 天蓝苜蓿含药血清的制备

小鼠100只，随机分为空白对照组、天蓝苜蓿水煎液高、中、低剂量组（实验组），每组25只，禁食不禁水过夜后，空白对照组每日灌服等体积蒸馏水，实验组每日分别灌服天蓝苜蓿水煎液5、10、20 g/kg(剂量分别为临床用量的 10、20、40 倍)，每日 2次(早晚进食前灌胃)，连续给药5天，于末次灌胃1h后无菌条件下心脏穿刺取血，3000rpm离心15min分离血清，0.22μm微孔滤膜，56℃，30min灭活。将空白血清和含药血清冷冻干燥成冻干粉，分装标示后－20℃保存备用。

2.3 细胞培养

K562细胞为悬浮液培养于含10%的胎牛血清，100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的1640培养液中，置于37℃、5%CO2的饱和湿度的条件下培养，1～2d更换培养液1次，取对数生长期细胞用于相关实验。

2.4 用细自动细胞计数仪测定细胞存活百分率

取对数生长期的K562细胞,制备单细胞悬浮液并作适当稀释，取20uL细胞悬液与细胞计数板上，在自动细胞计数仪上技术，测细胞成活率。并在光镜下观察细胞形态变化。

2.5 MTT法检测天蓝苜蓿含药血清对细胞增殖的影响

取对数生长期的K562细胞，调整浓度为5.0×105/mL，每孔90uL接种于96孔板。实验组加入天蓝苜蓿高、中、低剂量含药血清冻干粉1640培养液10uL使终浓度分别相当于在体高、中、低剂量浓度），对照组加入等体积DMSOK562细胞为对照组，以不含细胞的培养基作为空白对照组，每组设3个平行孔，置于37℃、5%CO2的饱和湿度的条件下培养 24、48、72h 后，加入 20μLMTT（5mg/mL）继续培养 4h，每孔加入150μLDMSO，轻轻震荡10min，待结晶物完全溶解后，于酶标免疫检测仪上以测定波长为570nm波长处读取各孔的吸光度（A）值。按公式计算细胞生长抑制率。

抑制率=｛（A阳性对照孔-A实验孔/A阳性对照孔-A空白孔｝×100%

2.6 统计学分析

实验数据采用SPSS17.0软件进行单因素方差分析，实验结果采用±s表示

3 结果

1）未经药物处理的细胞成活率98.6%

2）天蓝苜蓿含药血清对人白血病K562细胞凋亡形态的影响未经药物处理的对照组。K562细胞多呈圆形，经不同浓度天蓝苜蓿含药血清处理后，均出现明显凋亡形态，包膜皱缩，有泡状突起及不规则凹陷，胞核染色质浓缩，固缩，浓染，断裂成小团块分散在胞膜周边，以至形成凋亡小体。

3）天蓝苜蓿含药血清对人白血病K562细胞增殖的影响。不同浓度天蓝苜蓿含药血清作用K562细胞48h后，置于全自动连续光谱酶标仪在570nm处测定A值。按公式：细胞存活率%=（加药细胞A/对照A）×100%，从而得出天蓝苜蓿含药血清对K562细胞作用的半数抑制浓度（IC50）为0.8mol/L。

不同浓度天蓝苜蓿含药血清作用K562细胞24、48、72h后，置于全自动连续光谱酶标仪在570nm处测定A值。见表1。

表1 天蓝苜蓿含药血清对白血病K562细胞增殖抑制率（%）

可见24h、48h和72h后，与对照组相比低、中、高三组随剂量增加细胞存活率越低，有浓度依赖关系，各浓度间有显著性差异（P＜0.05）。随作用时间的延长，抑制作用增强，各时间段之间的差异有显著性（P＜0.05），呈时间依赖关系。

4 讨论

中医认为白血病属 “虚劳”、“热劳”、“湿病”、“癖积”、“痰核”、“血证”之范畴，发病原因是由于人体正气虚弱，受到邪毒的侵袭，内因外因相互作用而发病；七情内伤、饥饿劳累、房事过度，损伤精髓、肝脾及三焦，使阴阳气血、脏腑功能失调，正气内虚，复感六淫外邪或瘟毒而致病。过去，临床上对于白血病的治疗大都采用化疗方法，其疗效快，但副作用大，极易产生耐药性，目前临床多采用中药与化疗配合疗法，中药治疗白血病的特点有：①中药可增加化疗敏感性；②中药可对抗化疗副作用，保护骨髓造血功能的恢复，防止化疗药物引起严重的骨髓抑制；③中药可诱导白血病细胞凋亡，④中药可诱导白血病细胞向正常细胞转化等[5]，且中药药源广泛，价格低廉，宜长期服用等优点，也是一般放、化疗药所不能相比的。因此，利用中药、天然药物抗白血病，配合化疗和骨髓移植治疗，己经日益受到广泛重视。

K562细胞株系人慢性髓细胞白血病急变细胞株，费城染色体（Ph）阳性。在受到多种因素的诱导时，具有向红系，单核系或巨核细胞分化的能力，是研究药物作用、细胞凋亡、细胞分化、基因转录及蛋白表达的良好靶细胞[6]，该细胞广泛用于抗白血病作用的研究如：吴东等[7]以K562细胞为实验对象，研究小檗胺抗白血病作用；张启国等[8]研究了藤黄酸对K562细胞的凋亡作用的诱导；易娟等[9]用K562细胞研究了小白菊内酯抗白血病作用诱导凋亡是化疗药物抗白血病的重要机制。细胞凋亡是一种在基因控制下的细胞主动死亡过程，以核酸内切酶活化后将DNA分解为180bp整倍数的片断DNA为特征。形态学上表现为细胞起泡，核固缩。天蓝苜蓿含药血清作用明显，要抑制肿瘤细胞的生长。本研究采用MTT法观察了天蓝苜蓿含药血清对人白血病K562细胞增殖有抑制作用，其IC50值为0.8mol/L，显示出天蓝苜蓿含药血清对K562细胞有杀伤作用。人白血病K562细胞经天蓝苜蓿含药血清处理后，细胞均出现明显凋亡形态，胞膜皱缩，胞核固缩，浓染，断裂成小团块分散在胞膜周边，以致形成凋亡小体。用不同浓度天蓝苜蓿含药血清处理白血病细胞株K562，24、48、72h后，发现呈时间和剂量依赖关系，因此，后续实验建议使用高剂量。