赵丽华，李甜饴，刘改霞，程兴茹，李如冰，李文静,2,3⋆

(1.廊坊师范学院，河北 廊坊 065000;2.河北省动物多样性重点实验室，河北 廊坊 065000;3.廊坊市细胞工程与应用研究重点验室，河北 廊坊065000;4.巴彦淖儿市食品药品检验所，内蒙古 巴彦淖儿 015000)

0 引言

水孔蛋白属于古老的广泛存在于所有生物里的主要膜内在蛋白（major intrinsic protein，MIP）家族，在生物的物质代谢中起着重要作用［1］。根据序列同源性和亚细胞定位的不同，水孔蛋白可以分为4 类，包括液泡膜内在蛋白（tonoplast intrinsic protein，TIP）、质膜内在蛋白（plasma membrane intrinsic protein，PIP）、NOD26-like内在蛋白（NOD26-like intrinsic protein NIP）和小的内在蛋白（small and basic intrinsic protein，SIP）［2-3］。后来人们又在苔藓中发现了X 内在蛋白（X intrinsic protein，XIPs），该蛋白仅在少量高等植物和大量低等植物中存在［4］。迄今为止，植物中水孔蛋白的研究主要集中在PIPs 上。甘蓝型油菜属于十字花科芸薹属双子叶植物，目前对其研究大多集中于脂肪酸组成及代谢［5-10］以及蛋白参与植物对生物和非生物胁迫的响应调控方面［11-15］，对于甘蓝型油菜AQP（Aquaporin）水孔蛋白研究较少。

因此，本文利用生物信息学软件对油菜BnTIP2;3蛋白的理化性质、二级结构和三级结构进行分析，为其生物学功能的研究奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

甘蓝型油菜幼苗种于廊坊师范学院生命科学学院培养室。选取健壮植株的叶片，用去离子水清洗表面，吸水纸吸干，然后用液氮速冻，-80℃保存，用于水孔蛋白基因克隆。

1.2 主要试剂

DNA marker、10×Loading Buffer、DNA 聚合酶、10×PCR Buffer、限制性内切酶SacΙ、BamHΙ。克隆载体pTOPO-Blunt cloning kit、MiniBEST Plant RNA Extration Kit、PrimeScript ™ II 1st Strand cDNA Synthesis Kit，均购于大连TaKaRa 公司。大肠杆菌（Escherichia coli）菌株由廊坊师范学院植物遗传实验室保存。

1.3 油菜总RNA提取及cDNA合成

根据MiniBEST Plant RNA Extration Kit 说明书提取油菜幼苗总RNA，取2 μL 于1%琼脂糖凝胶上电泳检测其完整性。以总RNA为模板，使用Prime-Script™II 1st Strand cDNA Synthesis Kit 进行反转录，合成cDNA第一条链，作为模板进行PCR扩增。

1.4 油菜BnTIP2;3基因cDNA序列克隆

根据GeneBank 中收录的BnTIP2;3基因序列，设计一对引物进行PCR 扩增。PCR 条件为：94℃预变性4 min；94℃变性30 s，55℃复性30 s，72℃延伸1min，共30 个循环；72℃延伸10 min。PCR 产物经电泳检测后对目的片段进行凝胶回收。取适量回收纯化产物与pTOPO平末端载体连接，转化大肠杆菌感受态细胞Trans10。将阳性克隆送至上海美吉生物公司测序。

1.5 BnTIP2;3的生物信息学分析

对测定序列用ExPASy ProtParam，预测BnTIP2;3编码氨基酸序列分子质量、等电点疏水性；利用Signal P 3.0 Server 进行信号肽预测；利用TMHMM Server 2.0 进行蛋白跨膜区预测；利用NCBI 网站上的CDD 分析BnTIP2-3 蛋白保守域。利用YLoc 进行亚细胞定位分析；利用SOPMA 和SWISS-MODEL软件预测其二级和三级结构。将BnTIP2;3 蛋白全长序列提交到NCBI的BLASTP中获得其同源序列，利用MEGA7 进行系统发育分析，分支处的数字表示该分支分析的可靠程度，数值越大、可信度越高。

2 结果与分析

2.1BnTIP2;3基因的克隆

根据油菜BnTIP2;3序列，从油菜幼苗中RTPCR 扩增得到一条753 bp 的DNA 序列（图1）。将PCR 产物与pTOPO-Blunt Cloning vector 进行连接、转化，选取阳性克隆进行菌落PCR 扩增，得到一条与ORF 全长一致的片段。进一步对重组质粒进行双酶切验证，酶切获得一条1865 bp pTOPO-Blunt Cloning vector 和一条753 bp 目的基因片（图2）。综上所述，BnTIP2;3编码250个氨基酸，成功获得重组质粒pTOPO-BnTIP2;3。

2.2 BnTIP2;3的理化性质分析

利用ExPASyProtParam 在线分析BnTIP2;3 蛋白的序列组成和理化性质。BnTIP2;3 分子式为C1171H1834N282O327S5，相对分子量为25.25 kDa，理论等电点（pI）为4.84，该蛋白由20种250个氨基酸组成，含量最高的3种氨基酸分别是：甘氨酸（Gly）14.4%、丙氨酸（Ala）13.2%和缬氨酸（Val）12.0%。总平均疏水性、脂肪族指数和不稳定指数分别为0.970、122.88和22.00，表明该蛋白为稳定性蛋白。

图1BnTIP2;3基因RT-PCR扩增产物

图2 pTOPO-BnTIP2;3载体双酶切鉴定图

2.3 BnTIP2;3蛋白跨膜结构域预测与分析

运用TMHMM Server 2.0 软件对BnTIP2;3 蛋白的跨膜结构域进行预测（图3）。结果表明BnTIP2;3 含有6 个跨膜螺旋、属于跨膜蛋白。亚细胞定位显示该蛋白为分泌型蛋白，与跨膜结构域分析结果一致。

图3 BnTIP2;3蛋白的跨膜螺旋区分析

2.4 BnTIP2;3蛋白信号肽预测

采用在线软件SignalP 5.0 Server 对BnTIP2;3蛋白信号肽进行预测，结果表明BnTIP2;3序列中无明显的信号肽序列。

图4 BnTIP2;3蛋白软件的信号肽分析

2.5 BnTIP2;3蛋白的亲水性和疏水性预测

图5 BnTIP2;3蛋白的亲水性分析

采用ProtScale 软件对BnTIP2;3 蛋白的亲水/疏水性进行预测（图5）。通过对242 个氨基酸（5-246）综合分析，发现204个氨基酸（84.29）分布在高分值区，总得分为264.177；而38个氨基酸分布在低分值区，总得分为-25.048。由此可见，BnTIP2;3蛋白存在大量疏水氨基酸残基，为疏水性蛋白质。

2.6 BnTIP2;3保守结构域分析

利用NCBI的CDD对甘蓝型油菜BnTIP2;3氨基酸的功能结构域进行预测分析（图6）。结果表明BnTIP2;3氨基酸序列中含有两个NPA保守结构域，属于MIP超家族成员。

图6 BnTIP2;3蛋白保守域分析

2.7 BnTIP2;3蛋白二级结构预测与分析

采用SOPMA 对BnTIP2;3 二级结构进行预测，结果表明该蛋白ɑ-螺旋（H）占35.6%，延伸链（E）占21.6%，β-转角（T）占5.2%，无规卷曲（C）占37.6%。由此可见，BnTIP2;3 蛋白主要的二级结构元件是无规则卷曲和ɑ-螺旋。

2.8 BnTIP2;3蛋白三级结构预测

采用SWISS-MODEL在线软件对BnTIP2;3蛋白进行同源建模，对其三级结构进行预测。根据5i32.1进行建模，序列同源性为77.08%，全局模型质量评估值为85%，说明该预测结果可靠（图7），且与二级结构预测结果一致。

图7 BnTIP2;3蛋白三级结构预测

2.9 BnTIP2;3蛋白的系统发育分析

将甘蓝型油菜基因编码的氨基酸BnTIP2;3 序列在GenBank 进行Blastp 搜索，发现BnTIP2;3 与多种植物水孔蛋白具有较高的序列相似性。选取同源性较高的7 条序列，白菜型油菜（Brassica raoa、XP_009101423.1）、芥菜（Capsella rubella、XP_006284410.1）、拟南芥（Arabidopsis thaliana、NP_199556.1） 、亚麻芥（Camelina sativa、XP_010441462.1）、台湾南芥（Arabis alpine、KFK_31373.1） 、 亚麻芥（Camelina sativa、 XP_010440021.1）、羽衣甘蓝（Brassica oleraceavar.olera、XP_013605765.1）进行系统进化树构建（图8）。结果表明，来自8 个不同植物的TIP2-3 聚成2 个分支。BnTIP2;3 与拟南芥（Arabidopsis thaliana）、亚麻芥（Camelina sativa）以及台湾南芥（Arabis alpine）亲缘关系较近，这与他们均隶属十字花科植物的进化及分类地位较一致。

图8 不同植物TIP2;3蛋白的系统发育树

3 讨论

植物水孔蛋白主要包括定位于液泡的TIP蛋白和定位于质膜的PIP 蛋白，其中TIPs 根据N 端和C端序列不同，基于系统进化分析按照种类多少分为TIP2、TIP4、TIP1、TIP3和TIP5五个亚类。其TIP2和TIP1 两种水通道蛋白在基因组中大量存在，而TIP5 在植物种类中罕见存在［16］。

本文首次以油菜BnTIP2;3蛋白为研究对象，通过基因克隆及各种生物信息学软件对其理化性质、二级结构和三级结构等进行预测分析，发现BnTIP2;3是一种由20种250个氨基酸组成、无信号肽、含有6个跨膜结构域、稳定的疏水性蛋白质。功能结构域预测显示BnTIP2;3具有PLN00168结构域，属于MIP超家族基因。系统进化分析表明BnTIP2;3 与拟南芥、亚麻芥、台湾南芥亲缘关系较近，与传统分类地位一致。以上结果对于全面确立水通道蛋白在植物中的功能起到重要作用。

4 结论

采用一系列在线生物信息学软件对油菜BnTIP2;3蛋白的理化性质和各级结构进行预测分析，发现BnTIP2;3 是由20 种250 个氨基酸组成，不含信号肽结构，具有跨膜结构域，属于稳定的疏水蛋白质；ɑ-螺旋和无规则卷曲是BnTIP2;3 蛋白二级结构的主要组成元件。该项工作的开展，为将来深入了解油菜BnTIP2;3基因的生物学功能奠定了基础。