薛绮雯

（复旦大学生命科学学院，上海 200438；上海伯豪生物技术有限公司，上海 201203）

外周神经损伤后经常会导致神经源性痛，这种疼痛的性质为痛觉过敏[1]。外周神经损伤动物模型代表了神经源性痛的一种动物模型。研究表明，外周神经损伤可以引起背根节神经元中的神经肽、受体、离子通道和神经营养因子长时程的基因表达的变化。这些基因的表达改变可能与神经性痛的产生和维持有关。

常用的外周神经损伤动物模型包括：坐骨神经轴索切断模型[2]、坐骨神经慢性压迫模型（CCI）[3]、坐骨神经部分损伤模型（PSL）[4]、脊神经选择结扎模型（SNL）[5]和坐骨神经分支选择损伤模型（SNI）[6]。后4种模型的模式图见图1。

ceRNA调控网络成员包括mRNA、lncRNA、circRNA和假基因。在一些转录本之间，成员间拥有共同的miRNA应答元件MREs，通过竞争性结合miRNA，互为ceRNA，从而相互调节彼此功能[8]。

1 材料与方法

1.1 主要仪器

MicroCL 17R 离心机，Thermo Fisher；GENE VORTEX-2 振荡器，Scientific Industries；NanoDrop ND-2000 紫外分光光度计，Thermo Fisher；Agilent 2100 生物芯片分析系统，Agilent；G5761A 型 Agilent Technologies SureScan Dx Microarray Scanne，Agilent；G2534A 型不锈钢杂交芯片架，Agilent；G2534-60013型芯片垫片，Agilent；G2545A型杂交恒温箱，Agilent；HB-100型加热模块，杭州博日科技有限公司；9700型 GeneAmp PCR 仪，Applied Biosystems

图1 神经病理性疼痛的动物模型和模型检测方法[7]

1.2 主要试剂

TEIzol Reagent（ACS，Invirtogen，美国）；氯仿（AR，国药集团化学试剂有限公司，中国）；异丙醇（AR，上海实验试剂有限公司，中国）；无水乙醇（AR，Sigma-Aldrich，美国）；RNeasy mini Kit (250)（ACS，QIAGEN，德国）；单标低起始量快速扩增标记试剂盒（ACS，Agilent，美国）；单标RNA插入试剂盒（ACS，Agilent，美国）；基因表达杂交试剂盒（ACS，Agilent，美国）；基因表达洗涤试剂盒（ACS，Agilent，美国）；含RNase抑制剂的高效cDNA逆转 录 试 剂 盒（ACS，Applied Biosystems，美 国 )；Power SYBR Green PCR Master Mix（ACS，Applied Biosystems，美国）；无核糖酶水（ACS，Ambion，美国）

1.3 实验方法

1.3.1 动物模型的建立与取材

采用Decosterd和Woolf建立的SNI外周神经损伤疼痛模型。取2个月大的SLAC C57小鼠经复合麻药（甲苄噻嗪 10 mg/kg，氯胺酮 95 mg/kg，乙酰丙嗪0.7 mg/kg）腹腔注射麻醉后，剃毛消毒，沿胫骨切开皮肤，钝性分离股二头肌暴露出坐骨神经及其末端腓肠神经、腓总神经和胫骨神经三支分支（图2）[6]。用玻璃分针找到腓总神经和胫骨神经，用10-0的医用丝线将腓总神经和胫骨神经紧紧结扎，在结扎远端将其切断并将远端的神经根切去2～4 mm，保持完整的腓肠神经，逐层缝合肌肉、筋膜和皮肤，消毒后放至温暖处等待小鼠苏醒。手术过程中注意避免对腓肠神经有接触和牵拉。控制组操作过程同上，但不结扎和剪断神经。分别在手术后6h、2d、7d、14 d和28 d，小鼠经异氟烷麻醉后用20 mL生理盐水心脏灌流，取L4-6背根神经节（DRG）。TRIzol法提取总RNA，实验设3次重复。

图2 坐骨神经分支选择损伤模型示意图

1.3.2 总RNA的提取与纯化

每 100 mg组织加入 1 mL TRIzol试剂，并用均浆器匀浆。加入200 μL的氯仿，震荡混匀1 min，静置5 min，离心 15 min。小心取出上清液，避免触及中间层，将上清液推入新的1.5 mL离心管，加入600 μL异丙醇，轻轻颠倒混匀，室温静置 5 min，离心 15 min。吸去上清，保留沉淀，并向沉淀中加入600μL 70%乙醇，离心10 min，洗涤沉淀。吸去上清，沉淀室温自然晾干后加入适量无核糖酶水，用移液器枪头吹吸，并充分溶解沉淀。用NanoDrop ND-2000超微量分光光度计测定RNA含量，并用Agilent 2100生物分析仪电泳质检合格后取7 μg总RNA使用RNeasy mini Kit进行纯化。纯化后再次用NanoDrop ND-2000超微量分光光度计测定RNA浓度。样本于-20 ℃保存。

1.3.3 ceRNA芯片实验

1.3.3.1 RNA的放大和标记

实验样品RNA采用单标低起始量快速扩增标记试剂盒和标准操作流程对样品总RNA进行放大和标记，并用 RNeasy mini kit纯化标记后的 cRNA。

1.3.3.2 芯片杂交

按照Agilent表达谱芯片配套提供的杂交标准流程和配套的基因表达杂交试剂盒，在65 ℃、10 r/min滚动杂交炉中滚动杂交17 h，杂交cRNA上样量1.65 μg，并在洗缸中洗片，洗片所用试剂为基因表达洗涤试剂盒。

1.3.3.3 芯片扫描

完成杂交的芯片采用安捷伦微阵列扫描仪进行扫描，软件设置染料通道：绿色，扫描分辨率为3 μm，光电倍增管（PMT）100%，20 bit。用特征提取软件 10.7（Agilent technologies，Santa Clara，CA，US）读取数据，最后采用R软件中limma包进行归一化处理，所用的算法为Quantile。

1.3.4 生物统计学方法构建ceRNA网络

首先通过ceRNA机制分析挖掘功能circRNA，将circRNA和mRNA做差异并集，进行miRNA预测。分析方法：circRNA和mRNA表达正相关，且结合相同的miRNA。结合预测方法：circRNA-miRNA预测采用targetscan和miRanda两个数据交集取前10；miRNA-mRNA预测为targetscan结果。构建ceRNA网络，然后与 mRNA 的 IPA（Ingenuity Pathway Analysi，一款数据分析软件）结果进行关联。通过数据对比，找出一些候选研究对象。

然后是对lncRNA进行功能挖掘。常规使用的研究方法为：通过lncRNA预测miRNA和mRNA。而本研究采用通过找lncRNA和mRNA有无结合关系，直接从序列上进行预测。通过lncRNA和mRNA之间的表达丰度相关性推测lncRNA的功能。通过Banding到DNA来看转录调控，Banding到RNA来看降解、翻译的过程。

1.3.5 RNA SYBR Green 荧光定量 PCR

使用含RNase抑制剂的高效cDNA逆转录试剂盒进行 cDNA 第一链合成，使用 Power SYBR Green PCR Master Mix进行 SYBR Green qPCR，将 9 μL 基因特异性qPCR反应液和1μL的样品加入384孔板中。将384 孔板置于 QuantStudio 5 Real-Time PCR System 中，用软件 QuantStudio™ Design & Analysis Software 运行，程序如下：50 ℃，2 min；95 ℃，10 min；（95 ℃，15 s；60 ℃，1 min）40 循环。Gapdh 作为定量实验内参，引物采用Primer Express 3.0.1软件设计，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

2 结果与分析

2.1 通过ceRNA机制分析挖掘功能circRNA

图3展示了有显著变化的经典通路之间的联系，圆形为mRNA，菱形为circRNA,线为miRNA。

图3 ceRNA网络图

通过条件circRNA与miRNA结合位点≥2进行数据筛选，然后与IPA结果进行关联。通过数据对比，找出一些候选研究对象，如表1所示。其中与行为相关：SNAI2、GRP、NETO1、ARAF；与癌症相关：SNAI2；与炎症反应相关：CD69、NFIL3、GRP。

2.2 通过ceRNA机制分析挖掘功能lncRNA

（1）差异交集lncRNA和mRNA：交集基因总表，计算皮尔逊相关系数，筛选相关性高的，构建网络；得到lncRNA-mRNA共表达总表；（2）进行lncRNA筛选：选取degree最高的3个lncRNA（其大小可以衡量lncRNA的核心程度），分别将其共表达mRNA筛选出来，找到lncRNA和mRNA为同一SOM结果中的Base；（3）将筛选出的子网络mRNA结果与IPA结果关联，通过数据对比，找出一些候选研究对象。

表1 circRNA-mRNA候选研究对象

相同Base中的circRNA-mRNA，通过数据对比，找出一些候选研究对象。其中与行为相关：CRH、SLC6A4、UCN、CCKBR、FGF3。图4展示预测构建的lncRNA-mRNA共表达网络，图5为Degree最高的3个lncRNA-mRNA子网络图。

图4 lncRNA-mRNA共表达图

2.3 定量PCR验证芯片结果

选择17个基因，在18个样本中验证其表达情况并与芯片结果进行对比，每个样品重复检测3次，检测结果取平均值。采用相对threshold cycle(2-ΔCt)方法计算相对表达水平，其中circRNA、lncRNA、mRNA定量以Gapdh作为内参基因。如图6所示，Aim1、cicRNA.14884、cicRNA.7871、cicRNA.8088、NR_003185、NR_045976、ENSMUST00000187198、Epb41l4a、Snai2和Zswim2的定量结果与芯片结果吻合。Real-Time PCR数据中横坐标为样本名称，纵坐标为2-ΔCt。芯片数据中横坐标为样本名称，纵坐标为芯片归一化信号值。

图5 Degree最高的3个lncRNA-mRNA子网络图

图6 定量PCR与芯片结果比较

3 讨论与结论

实验通过 mouse ceRNA 芯片对 0 h、2 d、6 h、7 d、14 d 和 28 d 这 6 个时间段的小鼠背根神经节组织进行基因表达分析，筛选在背根神经节中异常表达的基因，通过ceRNA机制分析挖掘功能circRNA、lncRNA。国内外有很多通过ceRNA机制挖掘抑癌基因，研究肿瘤、呼吸系统等疾病因及诊治的报道，但在背根神经节中的研究尚属首次。在此基础上，为排除由于个体差异、组织异源性等因素引起的假阳性实验结果，通过增加实验的重复性和可靠性，对6个时间段的样本都进行3次重复实验，并应用实时荧光定量PCR技术对18例样本挑选了17个基因进行Real Time PCR验证。验证结果显示，mouse ceRNA芯片结果和实时荧光定量PCR结果一致，进一步证实了背根神经节中lncRNA和circRNA的差异表达。目前，对于lncRNA和mRNA、circRNA和mRNA的自身表达调控及参与调控其他基因的网络途径缺乏了解，因此通过生物学技术来探讨异常表达的这些基因的功能分类和调节途径。通过ceRNA机制，筛选在相同Base中的circRNA-mRNA，进行预测miRNA，构建ceRNA网络。一共找到1 733个有关系的circRNA-miRNA-mRNA，再次缩小范围并和mRNA的IPA结果进行关联，找到与行为相关的勾选研究对象：SNAI2、GRP、NETO1、ARAF；与免疫相关的候选研究对象：CD69、NFIL3、GRP。

接下来再利用lncRNA和mRNA挖掘lncRNA功能，并构建靶基因与其调控的lncRNA网络关系图。一共找到42个lncRNA-mRNA共表达关系，再次筛选Degree最高的3个lncRNA-mRNA子网络，将筛选出的子网络mRNA结果与IPA结果关联，通过数据对比，找出一些行为相关候选研究对象：CRH、SLC6A4、UCN、CCKBR、FGF3。以上工作为进一步研究这些异常表达的基因在背根神经节疼痛免疫等方面的发展提供了初步研究基础。

上述工作仅仅是初步将芯片数据中的差异基因进行ceRNA网络预测，构建了circRNA-miRNA-mRNA、lncRNA-miRNA-mRNA的ceRNA网络。接下来还可以进一步对上述利用生物信息学预测的基因进行验证。其中包括利用双荧光素酶报告实验，RT-PCR等实验验证lncRNA/circRNA和mRNA的表达相关性，通过RIP等手段验证lncRNA/circRNA和mRNA有共同的MRE，通过体外细胞实验验证靶RNA对miRNA有抑制作用，最后可以通过流式细胞实验、体外动物实验、临床试验等验证靶基因的生物学功能。