郭宁强

（平罗县第二中学，宁夏石嘴山 753400）

枸杞（LyciumbarbarumL.）属于茄科（Solanaceae）枸杞属（Lycium），通称茨圆或红果子[1]。抗坏血酸过氧化物酶（Aseorbateperoxidase，APX），也叫维生素C过氧化物酶，普遍存在于高等植物、真核藻类和部分蓝细菌中，在部分昆虫中也检测出APX活性[2]。抗坏血酸过氧化物酶属于末端氧化酶的一种，在1976年才被Foyer和Halliwell发现[3]。近十几年来，其重要的生理生化功能受到研究者的广泛关注。

抗坏血酸过氧化物酶（APX）是一种亚铁血红素蛋白[4]，对底物抗坏血酸（Ascorbic acid，AsA）有极高的专一性[5]。AsA是植物体内合成的一类己糖内酯化合物，在植物的生长以及发育中发挥着重要作用，如抗氧化和清除自由基、光合作用和光保护、细胞的生长和分裂以及参与乙烯的合成等[6]。

APX是众多植物活性氧代谢中非常重要的抗氧化酶之一，不仅是植物叶绿体中清除H2O2的关键酶，还是维生素C代谢中主要的酶类。而在植物的光合作用中起到一定的催化作用。经相关研究表明，通过对抗坏血酸过氧化物酶的克隆，可以提高植物的抗逆性和光合作用能力。目前，少见有枸杞抗坏血酸过氧化物酶的相关研究报道，本研究克隆到LbAPX基因cDNA片段，并对其序列进行生物信息学分析，分析结果为进一步研究该基因在枸杞中的功能研究奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

枸杞品种“宁杞1号”生长于育新公司试验基地，自然条件生长，于2015年6—7月采摘花蕾冰盒带回实验室。液氮速冻后贮于-80 ℃备用。

1.2 主要试剂

LA-Taq 聚合酶、连接载体 pMD™ 19-T Vector，TaKaRa 公司；RNA Plant Extraction Kit DP419，天根公司；普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒，天根公司；PrimeScriptTM1 Strand cDNA Synthesis Kit、SMART PCRcDNA Synthesis Kit，Clontech 公司。

1.3 主要仪器

KYC-1102C型恒温培养摇床，上海浦东物理光学仪器；高速冷冻离心机，意大利ALC公司；DTC型PCR仪，西安天隆科技有限公司；Gel doc2000型凝胶成像仪，美国BIO-RAD公司；DYY-8C型电泳仪，北京市六一仪器厂。

1.4 实验方法

1.4.1 总RNA提取和纯化、cDNA第一链的合成

1.4.1.1 总RNA的提取（TRIZOL法）

用北京天根公司（TIANGEN）的RNA Plant Extraction Kit DP419试剂盒对总RNA进行提取。

1.4.1.2 RNA的纯化与检测

为了防止基因组DNA污染，对总RNA样品进行DNAase I消化和苯酚/氯仿抽提纯化。纯化后，用1%琼脂糖凝胶进行电泳（电泳条件：1×TAE；130 V，15 min），后续对总RNA的质量进行了检测。若非常明显看到28S rRNA和18S rRNA的两条带，证明其完整性较好。若出现弥散状或条带看不清说明总RNA已严重降解。

1.4.1.3 cDNA第一链合成

参 照 SMART PCRcDNA Synthesis Kit说 明 书 对cDNA第一链进行合成。

1.4.2 LbAPX基因cDNA保守区片段的克隆

1.4.2.1 引物设计

根据先前枸杞花药蛋白质组学的研究中，质谱鉴定的肽段序列信息，进行了数据库搜索，通过对比番茄、烟草、大豆和棉花等同源基因的氨基酸序列保守区，采用primer5软件并设计LbAPX引物序列。

上游引物：5'-GGAATATGCAGAGAAGTATGCT GTAGATCAAG-3'。

下游引物：5'-CAAATCTTAAGCTTCCATTAGCT CCACCTC-3'。

1.4.2.2 PCR扩增

PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶进行电泳、染色以及凝胶成像系统拍照。

1.4.2.3 目的片段的回收

PCR目的片段采用TaKaRa公司的Agrose Gel DNA Extraction Kit回收。

1.4.3 大肠杆菌感受态细胞的制备、连接、转化及鉴定

1.4.3.1 大肠杆菌感受态细胞的制备

用CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞。

1.4.3.2 目的基因与T载体连接

回收产物 4 μL、SolutionⅠ 5 μL、pMD18-T Vector 1 μL 混合后离心混匀，在 16 ℃恒温条件下连接 3 h。

1.4.3.3 转化

连接产物10 μL，DH5α感受态细胞50 μL，二者混匀，冰上放置 30 min；随后 42 ℃热激 90 s，冰上放 5 min 后加入 200 μL LB 液体培养基，培养 1 h（110 r/min、37 ℃）；取LB培养液，均匀涂板在LB的固体培养基（100 μg/mL Amp），先正面培养 1 h，再倒置培养 12～16 h（37 ℃恒温）。

1.4.3.4 鉴定

用1.0%琼脂糖凝胶来检测PCR产物，其中阳性克隆的菌液送上海生工生物技术有限公司进行测序。

1.4.4 LbAPX基因系统进化分析

采用NCBI网站（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast）下载了部分来源于其他植物的APX类蛋白序列信息，经过BioXM2.6软件进行了同源性比对，用MEGA 4.1软件对上述植物的APX基因进行了系统发生分析。

2 结果与分析

2.1 RNA完整性检测

由图1可以看出，在0.1%的琼脂糖凝胶上，RNA泳道无背景，28S和18S两条带的带型清晰。经分光光度计测定其A260/A280介于1.8～2.0。表明提取到的枸杞花药总RNA质量较高，可用于后续的反转录研究。

图1 枸杞花药RNA电泳图

2.2 LbAPX基因cDNA保守区序列的获得及同源性分析

2.2.1 LbAPX基因cDNA保守区序列的获得

以枸杞花药cDNA为模板，经RT-PCR得到一条大小约为670 bp的特异片断，如图2所示。

对特异片段进行回收，随后连接和转化，进行阳性克隆筛选及PCR鉴定，鉴定结果如图3所示。

图2 枸杞LbAPX基因PCR

图3 枸杞LbAPX基因菌液PCR

对菌液进行测序，测序结果序列如表1所示。该序列长670 bp，具有完整的ORF。

2.2.2 LbAPX花药基因cDNA编码产物的同源性和系统发生分析

用Blast分析了LbAPX的ORF编码的氨基酸序列，结果如图4。其氨基酸保守结构区域位于3～145 AA，证明属APX超基因家族。该氨基酸序列与马铃薯植物叶绿体抗坏血酸过氧化物酶同源性高达96%。

图4 LbAPX基因氨基酸的保守结构域

采用MEGA4.1软件对枸杞、马铃薯、烟草、棉花和大豆等来自于不同物种的APX进行进化分析，结果如图5所示。从系统发生分析可看到，LbAPX与烟草和马铃薯的APX蛋白进化关系最近，与棉花的亲缘关系则相对较远。

图5 LbAPX蛋白的进化分析

表1 菌液测序结果

3 讨论与结论

APX蛋白是一类酸性、可溶性蛋白，已经发现的蛋白种类约200多种。伴随克隆技术的发展及APX蛋白的cDNA文库建立，人们渐渐认识到这是一类任何真核细胞中都普遍存在的蛋白质。研究发现，APX蛋白在植物中的功能主要集中在植物种子的萌发、植物细胞信号转导、植物营养物质代谢、物质运输、细胞周期的调控等方面。植物中该蛋白克隆已经有很多报道，尤其在对该蛋白的生理生化功能方面有相关报道。通过克隆技术，在马铃薯和番茄以及油菜植物中可调节植物的抗逆性[7-8]。

利用TRIZOL法提取了“宁杞1号”花药总RNA，采用 SMART PCRcDNA Synthesis Kit试剂盒合成cDNA，并设计引物克隆了抗坏血酸过氧化物酶的cDNA片段。通过相关软件进行了生物信息学分析，得到了长度为670 bp的片段和完整的ORF，该ORF长为456 bp，编码146个氨基酸。经cDNA编码产物的同源性和系统发生分析，表明枸杞LbAPX基因属于APX超基因家族。该氨基酸序列与马铃薯的同源性高达96%。实验结果为进一步深入研究LbAPX编码的蛋白在枸杞中的相关功能及相应的生理生化性质奠定了前期基础。