罗映，贺芸芬，刘建平

（1.上海奥浦迈生物科技有限公司，上海201318；2.上海复旦大学生命科学学院，上海200433）

下游蛋白纯化工艺平台主要包括发酵液澄清收获（离心或深层过滤）、亲和层析捕获过程、低pH病毒灭活孵育与中和、中间品深层过滤、阴离子层析、阳离子层析、纳滤除病毒、超滤渗滤和辅料添加等步骤[1]。超滤是利用切向流技术将目标蛋白质浓缩至目标浓度并将溶液进行置换。单克隆抗体分子量一般在150 KD左右，为了截留蛋白，通常选择小于目标蛋白三分之一分子量大小的膜包进行换液，所以30KD膜包在单克隆超滤渗滤中非常常用。使用超滤膜包将小分子盐透过，而目标蛋白不断地循环，将超滤缓冲液连续地加入到样品流罐，持续搅拌混合，从而达到换液目的[2]。

蛋白质具有复杂的分子结构，由一系列氨基酸组成，并通过折叠形成高级结构。蛋白质复杂的结构使蛋白质较易形成二聚体、多聚体，甚至不溶性颗粒[3]。尽管这些不溶性颗粒一般含量不多，几乎不会使蛋白药物的活性受到影响，但也有许多报道称，蛋白质聚合物和不溶性颗粒会引起免疫应答[4]。因此，在蛋白纯化工艺开发和制剂缓冲液及辅料筛选开发工作过程中，都会对不溶性颗粒进行观察与监测，避免不溶性颗粒的产生。聚集体是单抗类药物生产过程中一种常见现象，但是目前对聚集体形成的机制还不是很清楚。聚集体最初以二聚体或者蛋白片段的形式存在，随着热力学的趋向性，则会偏向于形成亚可见或可见的不溶性颗粒。另外，单抗分子在形成高级结构时，不能完全折叠或者只是部分折叠，暴露的疏水区域之间的疏水作用力也会导致聚集体的形成，甚至形成蛋白沉淀。蛋白异质性也是形成聚集体的一个因素，异质性高的蛋白之间更容易产生共价或非共价的相互作用，从而导致聚集体的产生。一般来说，在蛋白纯化的其他步骤中，使用除菌滤器可以去除不溶性颗粒；而超滤操作时，样品罐中的样品处于循环状态，通常这个超滤渗滤操作需4 h以上，过程中可使用搅拌子搅拌来保证样品储罐中的蛋白样品处于均一状态，蛋白在这个过程中会受到搅拌产生的剪切力等，从而影响蛋白的稳定[5]。目前工艺下，搅拌30 min后，便形成大量不溶性颗粒，膜包堵塞，透过端滤速不断降低。

因此，通过比较不同缓冲液体系换液、不同添加剂、过程中是否搅拌等因素，查找出不溶性颗粒产生的原因，并找到控制方法，使超滤渗滤得以顺利进行。

1 材料与方法

1.1 样品

CHO（中国仓鼠卵巢细胞）细胞培养液经澄清收获、亲和层析、阴离子层析、阳离子层析纯化后得到样品，蛋白浓度为8.7 g/L。

1.2 主要试剂及仪器

氨丁三醇、冰醋酸、三水醋酸钠、氯化钠、氢氧化钠、磷酸氢二钠、一水合磷酸二氢钠、L-精氨酸盐酸、一水合柠檬酸、柠檬酸钠、吐温80均购于J.T.Baker；海藻糖购于Pfanstiehl。所有药品均符合美国药典级。

超滤渗滤膜包（孔径30KD，聚醚砜材质，膜面积50 cm2，货号 PXB030A05）、压力表购于默克密理博公司；蠕动泵（Langer BT300-2J）购于兰格公司。

1.3 实验方法

实验采用切向流技术进行超滤渗滤，使用硅胶管道将超滤膜包、压力监测装置、泵等进行连接，具体见图1。将样品放入样品罐中，通过进样泵将样品进行循环，大于膜包孔径的蛋白样品将回流至样品罐中，小于30KD的小分子盐等物质透过超滤膜，同时渗滤缓冲液不断流加至样品罐中，保持流加速度与透过速度一致，样品罐中蛋白浓度便会保持不变，样品罐不断进行搅拌以保证样品均一的状态。研究中的最终处方蛋白浓度为10～12g/L，缓冲液成分为20 mmol/L磷酸氢二钠-磷酸二氢钠、10 g/L精氨酸、300 g/L海藻糖、0.02%吐温20，pH为6.0。在UF/DF开发过程中，考虑到海藻糖价格较高，使用不含海藻糖和吐温的缓冲液作为换液缓冲液，以下简称磷酸盐-精氨酸体系。不同实验中浓缩后的蛋白终浓度均为15g/L左右，在此浓度下进行换液操作。换液过程中每隔一个换液倍数记录透过端流速，将换液倍数作为横坐标，透过端流速作为纵坐标作图。

图1 超滤渗滤装置图

2 结果与分析

2.1 醋酸体系置换至磷酸盐-精氨酸体系

在超滤渗滤前样品经过阳离子层析进行纯化，在工艺开发初期，采用的缓冲液为50 mmol/L醋酸钠、155 mmol/L氯化钠，pH 5.0。实验中超滤膜包蛋白载量为150 g/m2。将蛋白从50 mmol/L醋酸钠、155 mmol/L 氯化钠、pH 5.0 中换液至 20 mmol/L 磷酸氢二钠-磷酸二氢钠、10 g/L精氨酸，pH 6.0。如图2所示，从醋酸体系置换至磷酸盐-精氨酸体系时，整个过程透过端流速降低非常快，膜包严重堵塞，整个过程观察到较多不溶性颗粒。因此，推测不溶性颗粒产生原因可能为缓冲液体系更换，使蛋白不稳定。除醋酸体系外，柠檬酸体系也是纯化中常用缓冲液。因此，在实验中尝试柠檬酸体系。

图2 醋酸体系置换磷酸盐-精氨酸透过端流速衰减图

2.2 柠檬酸体系置换至磷酸盐-精氨酸体系

将阳离子层析洗脱液更换为20 mmol/L柠檬酸钠、160 mmol/L 氯化钠，pH 5.0，从 20 mmol/L 柠檬酸钠、160 mmol/L 氯化钠，pH 5.0 换液至 20 mmol/L磷酸氢二钠-磷酸二氢钠、10 g/L精氨酸，pH 6.0。因蛋白量较少，实验中膜包蛋白载量为50 g/m2，此实验中样品罐为50 mL离心管，超滤过程中使用手动摇匀。本实验以2.1为对照，更换了缓冲液体系同时未使用搅拌。如图3所示，透过端流速未衰减，且无不溶性颗粒，初步确认为磷酸体系与醋酸体系之间的置换或搅拌使蛋白形成了不溶性颗粒。

图3 柠檬酸体系置换磷酸盐-精氨酸透过端流速衰减图

2.3 提高膜包载量

在实验2.2的基础上，将膜包蛋白载量增加了12倍，载量为 600 g/m2，实验样品罐为 500 mL 康宁瓶，超滤渗滤过程中使用搅拌使样品保持均一状态。从图4可知，整个过程透过端流速衰减较大，且观察到较多不溶性颗粒。因此，从柠檬酸体系换液至磷酸盐-精氨酸仍会产生不溶性颗粒。推测引起不溶性颗粒产生的因素为搅拌，在接下来的实验中进行验证。

图4 柠檬酸体系置换磷酸盐-精氨酸（提高膜载量）透过端流速衰减图

2.4 精氨酸含量及pH影响

通过阳离子洗脱条件比较，将阳离子层析洗脱缓冲液更换为20 mmol/L磷酸氢二钠-磷酸二氢钠、90 mmol/L精氨酸盐酸，pH 6.0，在同一缓冲液体系中进行超滤渗滤，两种缓冲液仅精氨酸含量及pH不一样，实验中超滤膜包的蛋白载量为320 g/m2，整个过程使用搅拌将样品罐中的蛋白保持均一状态。从图5可知，即使在同一体系中进行缓冲液置换，仍有不溶性颗粒产生，整个过程透过端流速降低。

图5 同种缓冲液置换透过端流速衰减图

由2.1～2.4的4个实验可知，导致不溶性颗粒产生的主要因素为搅拌。因此在不同缓冲液中进行搅拌实验证实搅拌为不溶性颗粒产生的主要原因。

2.5 不同缓冲液体系及添加剂对搅拌的影响

有文献指出，吐温可控制不溶性颗粒的产生[6]，并通过实验考察了磷酸盐体系、柠檬酸体系中搅拌对不溶性颗粒产生的影响；同时考察了添加吐温、海藻糖对不溶性颗粒产生的影响。各取0.05 L蛋白样品，使用搅拌子进行搅拌。观察搅拌30 min后的表现。加入吐温后的蛋白样品搅拌30 min后仍无不溶性颗粒产生。说明吐温20可以控制不溶性颗粒的产生。接下来的实验中将少量吐温20添加至UF/DF样品中，溶解后再进行UF/DF。

取部分蛋白，初始缓冲液为20 mmol/L柠檬酸钠、160 mmol/L氯化钠，pH5.0，浓缩至目标浓度后再进行换液，换液至20 mmol/L磷酸氢二钠-磷酸二氢钠、10 g/L精氨酸，pH6.0中，因吐温含量太高时易产生胶束，因此实验中控制最终吐温20的浓度为0.01%。加入吐温后，进行UF/DF过程。从图2可以看出，整个过程透过端流速降低较少，无不溶性颗粒产生。

图6 添加吐温后透过端流速衰减图

3 结论

以控制UF/DF过程中不溶性颗粒的产生为目的，对UF/DF过程中产生不溶性颗粒的原因进行了考察。比较了不同缓冲液体系间换液过程，发现即使同种缓冲液体系间进行操作仍会产生不溶性颗粒，在其中一个低载量的实验中未进行搅拌，未发现不溶性颗粒产生，从而找到了产生不溶性颗粒的原因是搅拌。通过查阅文献，发现吐温可控制不溶性颗粒的产生。吐温作为单抗处方中常用的辅料，通常在UF/DF后加入，本研究创新性地将吐温在UF/DF前加入，控制了不溶性颗粒的产生，使UF/DF工艺可行。