崔倩倩，刘朝阳

（1.中冶华天工程技术有限公司，江苏南京 210019；2.中国科学院南京土壤研究所，江苏南京 210008）

随着石油工业的发展，石油污染问题越来越引起人们的关注。据估计，全世界每年约有1×109t石油及其产品进入地下水、地表水及土壤中，对自然环境、人体健康、水产养殖等方面造成了严重影响。石油是由多种烃类和非烃类组成的复杂混合物，烷烃作为石油的重要成分，占石油中含量的50%～95%[1]。已有的研究报道表明，长链烷烃结构稳定，不易自然降解，大量存在被石油污染的环境中[2-3]。而原油中的饱和烃，特别是中间长度的烷烃（C10～C20）更容易被生物降解。烷烃是石油中含量最多的成分，正十六烷烃是烷烃中的一种重要成分，水溶性低、难挥发，一旦进入环境就很难被消除，属于持久性污染物[4]。

利用物理、化学方法处理石油烃可以得到较好的效果，但因造价高、二次污染等问题，其应用受到了限制[5]。相比物理和化学处理方法，生物处理方法具有很大的优势，微生物能够通过生物降解方式处理含油成分，具有处理效果好、 费用低、对环境影响小及应用范围广等优点。可以降解石油污染物的微生物种类繁多，可利用多种微生物混用来降解不同烷烃，但在实际应用中存在不同菌株适用条件不一致、菌群稳定性差等问题，应用受到限制，因此筛选得到一株高效的烷烃降解菌具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

酵母浸出粉，OXOID LP0021生物试剂；蛋白胨，北京奥博星生物试剂；NaCl、MgSO4·7H2O、(NH4)2SO4、K2HPO4、KH2PO4均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司；琼脂，国药集团化学试剂有限公司；正十六烷 烃，色 谱 纯，Sigma-Aldrich；TransStart FastPfu DNA聚合酶，北京全式金生物技术有限公司；细菌基因组DNA提取试剂盒、琼脂糖凝胶回收试剂盒，天根生化科技（北京）有限公司；PCR产物纯化试剂盒，Omega公司；DNA ladder，Thermo公司。

DR5000紫外可见光分光光度计，哈希；GC-2010 Pro气相色谱，日本岛津；PCR仪，北京东胜创新生物科技有限公司；LP5200P电子天平，德国Sartorius；MLS-3750全自动高压灭菌器，日本SANYO；SW-CJ-1F型单人双面净化工作台，苏州净化设备有限公司；恒温恒湿培养箱，苏州江东精密仪器有限公司；THZ-300C型恒温培养摇床，上海一恒科技有限公司。

1.2 样品采集

试验中用于筛选高效石油烃降解菌株的土壤样品采自东营胜利油田采油厂附近被原油重度污染的土壤。用以配制富集培养基的原油采自东营胜利油田采油厂原油。用以测定石油烃降解效果的废水取自某汽车生产厂内的含汽油、柴油废水。

1.3 培养基

富集培养基：原油1 g/L，酵母粉3 g/L，NaCl5 g/L，MgSO4·7H2O 0.25 g/L，(NH4)2SO41g/L，K2HPO410 g/L，KH2PO44 g/L，pH 为 7.2～7.4。

无机盐培养基：酵母粉 3 g/L，NaCl 5 g/L，MgSO4·7H2O 0.25 g/L，(NH4)2SO41g/L，K2HPO410 g/L，KH2PO44 g/L，pH 为 7.2～7.4。

分离培养基：酵母粉 5 g/L，蛋白胨 10 g/L，NaCl 10 g/L，琼脂 20 g/L，pH 为 7.0。

1.4 烷烃降解菌的富集分离

称取10 g受原油污染的土壤加入到富集培养基中，置于 30 ℃、150 r/min的摇床培养 7 d，然后取2 mL培养液到新鲜的富集培养基中继续培养7 d，取富集培养液1 mL，用无菌水按照体积比稀释为10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8的菌悬液，取100 μL稀释好的浓度梯度的菌悬液均匀地涂布在固体LB平板上，倒置放于30 ℃的恒温培养箱中培养；待长出单菌落后挑取形态差异较大的单菌落划线分离，挑取划线后单菌落菌株，LB斜面保存于4 ℃中。

1.5 烷烃降解菌的筛选

将挑取出来的单菌落活化，按1%比例转接到含正十六烷烃的无机盐培养基中，30 ℃、150 r/min培养24 h，测定菌株的OD600（菌液在 600 nm波长处的吸光度），选取生长状况较好的菌株作为初筛菌株，通过气相色谱测试初筛菌株对正十六烷烃的降解率，确定复筛菌株，得到对正十六烷烃降解率最高的菌株。

上述方法的测试方法为：正十六烷的萃取使用液-液萃取技术，用正己烷作萃取剂，用气相色谱火焰电离检测器（GC-FID）分析正十六烷的含量。具体操作方法如下：（1）将5 mL的培养液转移到50 mL离心管中，在培养液中加入2 mL色谱纯正己烷，剧烈搅拌2 min，将此混合液倒入分液漏斗中反复振荡，静置分层，吸取上层有机相至10 mL容量瓶中，按以上步骤重复萃取2次。合并萃取液在5 000 r/min下离心10 min，收集上层清液，用正己烷定容至25 mL，之后液体通过0.22 μm聚四氟乙烯过滤器。

GC-FID的测定条件为：AHP-5MS柱（Agilent，USA）（5%苯基柱，95%甲基硅；长30 m×直径0.025 mm× 膜厚度 0.25 μm）在 120 ℃下保持 1 min，以 20 ℃ /min 增加到 180 ℃，在 180 ℃下保持 5 min。氮气作为载流气体，控制流速恒定为1.5 mL/min。注射器和检测器的温度分别为250 ℃和270 ℃，注射体积为 2 μL。

1.6 烷烃降解菌的菌株鉴定

将筛选到的对正十六烷烃降解率最高的菌株离心收集菌体，采用细菌提取试剂盒提取细菌基因组DNA，并采用正向引物27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3' ）和反向引物 1492R（5'-CGGGCGGTGTGTACAAG-3' ）进行PCR扩增，回收扩增的片段送至美吉生物进行测序。将测得序列在GenBank数据库中经NCBI Blast检索比对，确定菌株种属。

1.7 烷烃降解菌的乳化能力

表面活性剂是烃类降解的主要影响因素，表面活性剂能增强有机物的亲水性，使生物降解速度得到很大程度的提高。乳化力测定：将培养液离心（9 000 r/min，4 ℃，20 min），取 2 mL 上清液加入 2 mL 正十六烷烃振荡5 min，观察分层液面的高度。

2 结果与分析

2.1 可降解长链烷烃微生物的富集分离结果

取在富集培养基中富集培养液梯度稀释涂布分离平板，如图1所示，分离挑取12株具有不同形态的单菌落菌株进行划线分离。将其划线得到纯化的菌株，LB斜面划线，4 ℃保存。

2.2 可降解长链烷烃微生物的筛选

将纯化后的单菌落活化，接种于含0.1%正十六烷烃的5 mL无机盐培养基试管中，将其放置于30 ℃、150 r/min的恒温振荡培养箱中振荡培养24 h，目测菌株P3、P7、P12菌液浊度较大，其他菌株培养液浊度较小。用分光光度计测定菌株的OD600，结果如图2所示。发现菌株P3、P7、P12生长状况较好，其中菌株P7的OD600最大，说明三株菌株可以以烷烃为唯一碳源生长。选取P3、P7、P12为初筛菌株，采用气相色谱法检测菌株对烷烃的降解率，确定P12为降解性能最好的菌株，如图3所示降解率达到74.8%。

图1 分离挑选的12株单菌落

图2 以正十六烷烃为唯一碳源的不同菌株的OD600

图3 初筛菌株对正十六烷烃降解率

2.3 菌种的鉴定

取P12菌株5 mL送上海美吉生物有限公司测序，测序结果 16S rDNA 基因序列长 2 065 bp，经GenBank中Blast检索比对，该菌株P12与Acinetobacter junii的相似度达99%，确定菌株P12为琼氏不动杆菌属（Acinetobacter junii），命名为Acinetobacter juniiP12。于2019年5月30日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心（简称CGMCC），地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，其保藏号为 CGMCC NO.17873。

2.4 菌株乳化能力测试

如图4所示，加入P12菌株上清液的正十六烷烃液面下降，有乳化现象产生。生物乳化剂属于表面活性物质，分子由疏水和亲水两部分构成，同时具有亲脂和亲水的性质，因此可增加油水的接触面积，从而促进微生物对石油类污染物的降解效果。

图4 P12菌株的生物乳化作用

2.5 菌株的最适降解条件

2.5.1 最适降解温度

将菌株Acinetobacter juniiP12接种到含有体积比为0.1%的无机盐培养基中，在转速为150 r/min和培养温度分别为 15 ℃、20 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃的恒温摇床中培养48 h，采用气相色谱法检测温度对菌株降解正十六烷烃的影响，结果见图5。由结果可以看出，菌株最适宜温度为30 ℃。温度直接影响酶的活性，而微生物作用于烃类主要依靠酶催化反应对其进行降解。该菌株适宜温度范围为25～40 ℃，具有较广的温度利用范围。

图5 Acinetobacter junii P12在不同温度下对正十六烷烃的降解曲线

2.5.2 最适降解pH

将P12接种到含正十六烷烃体积比为0.1%浓度的无机盐培养基中，将培养基分别调节pH为3、5、7、9、11，在转速为 150 r/min 和温度为 30 ℃的恒温摇床中培养48 h，采用气相色谱检测pH对菌株Acinetobacter juniiP12降解正十六烷烃的影响，结果见图6。pH值为6～8，菌株对正十六烷烃都具有较好的降解率，可在此范围内广泛应用，其中在pH为7的条件下降解效果最好。

图6 Acinetobacter junii P12在不同pH下对正十六烷烃的降解曲线

2.5.3 菌株对含石油烃废水的处理

将取自汽车生产厂内的含汽油、柴油的废水，用该废水配制无机盐培养基，将菌株活化培养的C12菌株转接到该无机盐培养基中，30 ℃、150 r/min继续培养7 d。同时设置对照组，用该废水配制无机盐培养基，不接菌，其余与实验组条件一致，分别对比两组中石油烃的含量。结果显示加入该降解菌可降解总石油烃的54%，说明该菌株对正十六烷烃不具专一性，也可以降解其他的烃类物质，在石油烃污染的水体中具有很好的应用潜力。

3 结论与展望

本研究获得的琼氏不动杆菌Acinetobacter juniiP12筛选自受石油污染的土壤中，因此该菌株进入石油污染的环境中能很快成为优势菌群，有效促进烷烃的降解，对污染修复具有很重要的作用。同时，该菌株是以单一菌株实现对烷烃的高效率降解，减少了混合菌株制备过程中不同菌株单独培养、分别活化、按比例混合等复杂操作步骤，方便应用，并且应用条件较好控制。此外，该菌株产生的生物乳化作用将提高烃类污染物在水中的溶解度，更有利于水体和土壤中石油类污染物的治理和生物修复。对于成分更复杂的原油物质，如果尝试将该菌株与其他优势菌株建立混合菌群，可通过菌群之间的协同作用，尝试解决对其他烷烃降解效果不足的问题，更有利于环境的治理[6-7]。在以后的研究中可以加强对极端环境下降解菌的研究，同时加强与分子生物学、物理化学等交叉学科融合创新，加强石油污染的联合修复和积极推广。