罗 茜，薛 红，卞兆连*

(江苏省南通市第三人民医院1 肝病研究所，2 重症感染科，南通 226006)

肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是源自肝脏的恶性肿瘤，其发病率、死亡率均居于恶性肿瘤的前列。我国的HCC 发病率较高，江苏南通等东南沿海一带更是我国HCC 的高发区之一[1]。目前HCC的病因和发病机制仍不明确，一般认为HCC 的发生是病毒感染、遗传等多因素长期作用的结果[2]，深入探讨HCC 的发病机制显得尤为重要。

长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)是一类长度＞200 nt，不具备蛋白质编码功能的RNA分子。过去lncRNAs 被误认为是“转录噪音”而未受到重视[3]。近来研究[4]表明，lncRNAs 在多种肿瘤的发生发展中扮演着重要角色，参与了肿瘤细胞的增殖、侵袭与转移、肿瘤血管生成等恶性生物学进程。在HCC 的发生发展过程中，通常伴lncRNAs 的表达失调，异常表达的lncRNAs 会导致肿瘤不可控制地生长甚至转移[5-6]。Z.H.WANG 等[7]通过遗传学图谱发现并确定了表观遗传诱发lncRNA1(epigenetically induced lncRNA1,EPIC1)在乳腺癌中表达显著升高，且与患者的不良预后相关。本研究对EPIC1 在HCC 中的表达和潜在功能进行检测。

1 材料与方法

1.1 一般资料 收集2013年9月—2018年3月在南通市第三人民医院肝胆外科确诊为HCC 并手术切除的48 例患者的配对组织，所有患者均签署知情同意书，并经南通市第三人民医院伦理委员会批准，其中男36 例，女12 例，平均年龄(58.38±11.22)岁。所有组织标本离体0.5 h 内浸泡于RNAlater 中，过夜后转移至-80 ℃冰箱存放。收集患者的临床病理及术前末次血清甲胎蛋白(alpha-fetoprotein,AFP)等资料。

1.2 细胞培养 从中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库购买人源肝癌细胞HuH-7、Hep 3B2.1-7、PLC/PRF/5、Li-7 和SK-HEP-1 以及正常肝脏上皮细胞系L-02。Li-7、L-02 细胞培养条件为RPMI-1640 培养基：90%，FBS：10%。HuH-7 细胞培养条件为高糖DMEM 培养基：90%，FBS：10%。Hep 3B2.1-7、PLC/PRF/5、SK-HEP-1 细胞培养条件为MEM 培养基：90%，FBS：10%。所有细胞均置于37 ℃、含5%CO2恒温箱中培养，每24 h 更换1 次培养基，当细胞融合度达到90%时开始传代培养。

1.3 实验试剂 RNAiso Plus(9109)、PrimeScriptTMRT Master Mix(Perfect Real Time)(RR036A)、TB Green®Premix Ex TaqTMⅡ(TliRNaseH Plus)(RR820A)均购自北京Takara 公司。

1.4 总RNA 的提取 取新鲜组织样本，加入1 mL RNAiso Plus 于冰上匀浆，室温静置后12 000 g 4 ℃离心5 min，在上清液中加入200 μL 氯仿，上下颠倒使之乳化，12 000 g 4 ℃离心15 min，吸取上清液，向其中加入1 mL 异丙醇沉淀RNA，12 000 g 4 ℃离心30 min，再加入1 mL 75%乙醇进行洗涤，7 500 g 4 ℃离心5 min 后弃乙醇，让沉淀RNA 在室温干燥后加入DEPC 水溶解，于NanoDrop-One 检测RNA的纯度及浓度。

1.5 逆转录及实时荧光定量聚合酶链式反应(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRTPCR) 取1 μg RNA 逆转录生成cDNA，在冰上配制反应体系。轻柔混匀后进行逆转录反应，条件如下：37 ℃15 min，85 ℃5 s，4 ℃∞。采用qRT-PCR 检测EPIC1 的相对表达水平。反应条件：95 ℃30 s；95 ℃3 s，60 ℃30 s，40 个循环。结果分析采用经典的2-△△ct法进行基因表达的相对定量。EPIC1 上游引物：5′-TACAAGCCAGGAACTGAACC-3′；下游引物：5′-ATAACAAAGCTCCACCGC-3′。内参β-actin 上游引物：5′-CCAACCGCGAGAAGATGA-3′；下游引物：5′-CCAGAGGCGTACAGGGATAG-3′。

1.6 统计学方法 本研究采用IBM SPSS Statistics 24 及GraphPad prism 8.0 进行统计分析。对于符合正态分布的计量资料以±s 表示。使用配对t 检验分析HCC 癌灶及邻近正常组织之间的表达差异，使用χ2检验分析EPIC1 与临床病理学参数的相关性。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 lncRNA EPIC1 在HCC组织中低表达 通过qRT-PCR 检测HCC 和癌旁组织中EPIC1 的表达情况，结果显示EPIC1 在HCC 和癌旁组织的表达分别为(13.28±36.66)和(62.84±108.93)，肝癌组织中EPIC1低于癌旁组织(P=0.006)(图1)。

2.2 lncRNA EPIC1 在肝癌细胞中低表达 qRTPCR 结果显示，相较于正常肝脏上皮细胞L-02，肝癌细胞中EPIC1 在5 种肝癌细胞系HuH-7(P=0.013)、Hep 3B2.1-7(P=0.001)、PLC/PRF/5(P=0.004)、Li-7(P=0.001)、SK-HEP-1(P=0.004)中的表达均明显下降(图2)。

2.3 EPIC1 的表达与HCC 患者病理分期相关 进一步分析EPIC1 表达与患者性别、年龄、术前末次AFP 水平、TNM 分期、肿块直径、微血管侵犯(microvascular invasion,MVI)等临床因素的关系。结果发现，EPIC1 表达量与患者性别(P=0.505)、年龄(P=0.858)、术前末次AFP 水平(P=0.966)、肿块直径(P=0.551)和MVI(P=0.233)均无相关，但与TNM 分期显著相关(P=0.033)(表1)。

表1 EPIC1 表达与患者临床参数的相关性

3 讨 论

我国作为一个“肝病大国”，每年新增的HCC 病例数占全球的一半以上，HCC 的防治工作尤为严峻。同时，因为HCC 发病隐匿，患者多在体检或肝病随访时B 超检查发现，加之现有的AFP、异常凝血酶原等血清学标志物缺乏足够的灵敏度和特异性，给临床上HCC 的早发现、早诊断带来难度。

起初认为lncRNAs 是不具备生物学功能的无用片段，随着基因芯片和二代测序技术的发展，lncRNAs 被发现可在染色质构象、转录水平和转录后水平等多个层面参与对下游分子或信号通路的调控，进而广泛影响生理病理过程[8]。lncRNA 常见的作用模式有：(1)作为顺、反式作用元件，调控基因转录；(2)通过特定的元件结合蛋白质分子，影响蛋白的分子活性和细胞内定位；(3)结合胞浆中的mRNA 前体或成熟体并在转录后水平对mRNA 进行修饰；(4)充当miRNA 海绵，竞争性结合miRNA，解除miRNA 对下游靶基因的抑制作用，从而调节下游靶基因的表达[9-11]。

大量的实验证据[11-12]表明在人体多种恶性肿瘤组织中lncRNAs 的表达谱发生了显著的差异表达，lncRNAs 可参与调控肿瘤细胞的增殖、侵袭转移等生物学过程。HOTAIR 被证实在乳腺癌中高表达，通过结合并调节PRC2 复合物，对组蛋白甲基化修饰调控相关基因的表达，从而促进乳腺癌细胞的侵袭、转移，同时HOTAIR 也是影响乳腺癌患者预后的独立危险因素。R.Q.JIANG 等[13]通过大规模临床样本发现lnc-EGFR 与肝癌患者Treg 及CTL 亚群分布关联，体内外实验表明lnc-EGFR 靶向EGFR/NFAT1 介导Treg/CTL 异常分布促进肝癌的发生发展。

Z.H.WANG 等[7]研究表明，EPIC1 能在一定程度上增强MYC-MAX 两者之间的相互作用。EPIC1 可能是通过调节MYC 上MYC-MAX 特异性的结合位点来影响MYC 的“占有率”，但对其他非特异性的结合并无明显影响。本研究发现lncRNA EPIC1 在HCC组织、细胞中呈低表达，进一步分析患者的性别、年龄、术前末次AFP 含量、肿块直径等临床参数，我们发现EPIC1 的表达与患者的TNM 分期密切相关，但和患者的性别、年龄、AFP 含量、肿块直径、MVI 均不存在显著的相关性。提示EPIC1 参与了HCC 的发生发展，但其具体的作用机制及调控机制尚不明确。深入探讨EPIC1 在HCC 的具体作用机制，有利于推进临床阐明HCC 的发病机制，为疾病的预防和靶向治疗等提供新的思路。