于云宝，林芷伊，满 洋，苗 章，朱东阳，张宏伟*，彭心宇*

(石河子大学医学院第一附属医院1 肝胆外科，2 肿瘤科，石河子 832008)

肝脏是人体最大的实质性消化器官，具有非常重要的生理功能。临床上多种原因能引起肝脏损伤，如手术、创伤、感染、坏死等，肝脏受到损伤后，残存的正常肝组织能够通过再生，迅速恢复至原有的体积和重量，最终实现肝组织结构的重建及肝功能的恢复[1]。干细胞移植技术是近20 多年来出现的新兴技术，具有良好的促进组织修复和再生的能力，已被广泛应用于各种临床慢性损伤性疾病的初级研究中。间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)是一种从中胚层和外胚层衍生出的多能干细胞，具有多项分化的潜能[2]。有研究[3]表明，将脐血来源的MSCs 移植入肝硬化大鼠的肝脏内，发现植入的MSCs 可以分化成为肝细胞。也有研究[4-7]证实，骨髓MSCs 能够直接分化为肝细胞，从而促进肝脏再生。

我们近期的研究[8]发现，MSCs 和内皮前体细胞(endothelial precursor cells,EPCs)之间有着非常密切的联系，EPCs 对MSCs 的自我更新及成骨、成软骨、成脂等分化均有一定的促进作用，因此推测EPCs 可能是MSCs 的支持细胞。另肝血窦的内皮细胞可以促进肝细胞的增殖[9]。因此，本研究拟探讨EPCs 在MSCs 向肝样细胞转化中是否也起到了促进作用，为今后干细胞联合移植提供一定的理论依据。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 SD 大鼠20 只，雌雄不限，4～6 周龄，体质量100～150 g，购自新疆乌鲁木齐市疾病预防控制中心，实验经石河子大学医学院第一附属医院伦理委员会讨论批准。

1.1.2 主要试剂和仪器 L-DMEM 培养基、EGM-2 MV BulletKit(CC-3156&CC-4147)、胎牛血清、青链霉素、胰酶(Hyclone 公司,美国)；肝细胞生长因子、成纤维细胞生长因子-4、内皮生长因子(Peprotech 公司,美国)；磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline,PBS)、地塞米松、1×细胞培养添加物(insulin、transferrin、selenium,ITS)、DAPI(Sigma 公司,美国)；0.1%Gelatin-Solution 明胶(北京索莱宝生物公司)；Trizol(Invitrogen公司,美国)；兔抗大鼠甲胎蛋白(alpha fetoprotein,AFP)抗体1∶200 稀释，兔抗大鼠清蛋白(albumin,ALB)抗体，1∶100 稀释(Abcam 公司,美国)；山羊抗兔FITC标记二抗，1∶100 稀释(购至北京中杉金桥生物公司)；CO2培养箱(Thermo 公司,美国)；荧光倒置显微镜(Leica 公司,德国)；低速离心机(Bio-Rad 公司)、超净工作台(Thermo 公司)、冰箱(海尔公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞分离、培养及鉴定 鼠骨髓来源MSCs和EPCs 的分离、培养及鉴定按本实验室前期的方法进行[10]，将细胞培养至第3 代备用。

1.2.2 肝细胞转化培养基的配制 α-MEM：10%胎牛血清(fetal calf serum,FBS)，10-7 μmol/L 地塞米松，1×ITS，20 ng/mL 肝细胞生长因子，20 ng/mL 成纤维细胞生长因子-4,20 ng/mL 内皮生长因子。

1.2.3 培养过EPCS 的无血清及因子的培养基(endothelial progenitor cell-conditioned medium,EPCs-CM)的提取 取第3 代EPCs，当细胞融合度达80%～90%时，吸走完全培养基，PBS 冲洗2 遍，吸尽PBS，加入不含血清及因子的空培养基，放入37 ℃、体积分数为5%CO2恒温箱培养，培养48 h 后，吸取培养基EPCs-CM 备用。

1.2.4 诱导MSCs 向肝样细胞的分化 MSCs 的培养分为3组。(1)实验组：使用EPCs-CM，与肝细胞转化培养基按1∶1 的比例培养MSCs；(2)模型对照组：无血清的α-MEM 与肝细胞转化培养基按1∶1 比例培养MSCs；(3)空白对照组：正常α-MEM 培养基培养MSCs。提前24 h 用0.1%明胶包被6 孔板，第3代SD 大鼠MSCs 用胰酶消化后，按照2×104/cm2的细胞密度接种于6 孔板中，每孔加入含体积分数为10%胎牛血清的低糖培养基(low glucose dulbecco′s modified eagle media,L-DMEM)，放入37 ℃、体积分数为5%CO2恒温箱培养，当细胞融合度达到40%～50%时，吸走完全培养基，3组分别加入对应培养基，放入细胞恒温箱进行培养，每3 d 换液1 次。观察细胞形态变化，并于诱导分化的3、5、7、9 d 收集细胞鉴定肝样细胞的特异性标志AFP、ALB。

1.2.5 细胞ALB、AFP 免疫荧光化学检测 将诱导3、5、7、9 d 的细胞用4%多聚甲醛室温固定10 min；PBS 37 ℃预温处理，清洗2 min×3 次；0.2%的Trition X-100 对细胞进行透化处理10 min；用PBS 清洗2 min×3 次；分别加入兔抗大鼠AFP 抗体(1∶200)和兔抗大鼠ALB 抗体(1∶100)，置于湿盒，4 ℃过夜；次日，37 ℃复温30 min，PBS 清洗2 min×3 次；暗室中加入山羊抗兔FITC 标记二抗(1∶100)，避光孵育60 min；PBS洗3 min×4 次；DAPI 染核30 s；吸除多余DAPI，PBS洗3 min×4 次；用荧光显微镜观察后拍照。

1.2.6 统计学方法 采用SPSS 23.0 统计软件进行数据分析，计量资料以±s 表示，采用两因素重复测量方差分析，P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 细胞形态的观察 光镜下显示MSCs 刚接种时多呈类圆形或椭圆形，约5 h 贴壁呈纺锤形，24 h内细胞体积增大，部分贴壁细胞开始分裂增殖。48 h后，贴壁细胞出现棒状、梭形、三角形等多形态样改变。第3～5 天，实验组和模型对照组细胞开始聚集，生长速度放缓，出现多核的成纤维样细胞，呈梭形或多边形改变，实验组比模型对照组出现形态变化的细胞数量多；空白对照组细胞生长速度未见变化，形态亦出现改变。第7～9 天，实验组和模型对照组细胞开始形成小梁样结构，细胞体积变大，呈多角形或梭形，胞浆丰富，可见多核，细胞生长速度变慢；实验组比模型对照组出现形态变化的细胞数量多，且出现小梁样结构时间早；空白对照组细胞生长速度未见变化，形态亦出现改变，见图1。

2.2 AFP 免疫荧光检测结果 MSCs 培养第3 天，实验组和模型对照组的AFP 免疫荧光染色即出现阳性染色，且染色强度和染色细胞数量均随时间延长逐渐增加；空白对照组在第3、5、7、9 天均未见免疫荧光染色。实验组AFP 浓度在第3、5、7、9 天明显高于模型对照组；模型对照组和实验组的AFP 浓度在第3、5、7、9 天均不全相同，并随着时间推移均呈上升趋势(图2，见封三)。

2.3 AFP 免疫荧光半定量数据检验 通过对学生化残差的分析，经Shapiro-Wilk 检验，实验组和模型对照组AFP 浓度数据均服从正态分布(P＞0.05)；通过学生化残差是否超过±3 倍的标准差判断，各组数据无异常值，见图3。

2.4 AFP 半定量数据分析 干预因素和时间的交互作用对AFP 的浓度的影响有统计学意义。模型对照组和实验组在不同时间点AFP 浓度均不全相同(P＜0.05)，且随着时间推移两组AFP 的浓度均呈上升趋势(P＜0.05)。在不同时间点实验组AFP 浓度均高于模型对照组(P＜0.05)，见图4、表1。

2.5 ALB 免疫荧光检测结果 MSCs 培养第7、9天，实验组的ALB 免疫荧光染色出现阳性染色，且染色强度和染色细胞数量均随时间增长逐渐增加；空白对照组和模型对照组在第3、5、7、9 天均未见免疫荧光染色，见图5(见封三)。

3 讨 论

MSCs是一种成体干细胞，来源于胚胎发育早期的中胚层和外胚层，主要来源于骨髓，属于多能干细胞，具有多向分化增殖潜能[2]、自我更新、自我复制、免疫调控[11]等特点，在特定的诱导条件可分化为肝样细胞、心肌样细胞、胰岛样细胞、神经样细胞、软骨样细胞、骨样细胞、脂肪样细胞[12]，是一种良好的组织工程学种子细胞。MSCs 目前具有重要的临床应用价值及科研价值，在创伤修复、血管疾病等领域的应用价值已经得到很好的体现。EPCs 的应用也很广泛且具有较高科研价值，在心肌梗死、血管生成、缺血性疾病等方面已有较多研究[13]，而且其在相关领域的应用价值也逐步扩大。本课题组前期研究发现，EPCs 在MSCs 向脂肪细胞、成骨细胞、成软骨细胞分化过程中，可以起到一定的促进作用。本课题组也研究发现，EPCs 是MSCs 的支持细胞之一，在促进MSCs 的自我更新(干细胞特性)方面有一定作用，对MSCs 干细胞特性的维持具有重要意义；MSCs 和EPCs 参与的生理过程相同，如血管生成，这与C.SEEBACH 等[14]的研究发现相似。因此，本研究探讨EPCs 在MSCs 向肝细胞转化中的作用，为今后临床联合干细胞移植提供一定的实验理论依据。

表1 实验组和模型对照组AFP 浓度数据分析(±s)

表1 实验组和模型对照组AFP 浓度数据分析(±s)

注：*交互效应的F 统计量和P 值。

目前，很多学者[15]已证实大鼠MSCs 可在成纤维细胞生长因子、肝细胞生长因子、内皮生长因子、地塞米松、胰岛素铁硒传递蛋白等多种因子联合诱导下，能在较短时间内分化为肝样细胞。这是一种较满意的诱导方法。EPCs 和MSCs 联合培养的研究发现加入培养过EPCs 上清液的MSCs 经转化培养，较单纯用肝细胞转化培养基培养的MSCs，在倒置显微镜下观察可见细胞形成小梁样结构，出现多角形和不规则形态，体积变大，胞浆变丰富，细胞内颗粒增加的时间及数量均明显增多；在荧光倒置显微镜下观察细胞表达ALB 和AFP 的数量也增多、时间提前，这表明EPCs 促进了MSCs 向肝样细胞的转化，细胞具备了部分肝细胞的功能。

ALB、AFP 均为肝系细胞的特异性标志[16]。细胞AFP 免疫荧光检测显示，MSCs 在培养过EPCs 的上清液刺激下，细胞中出现AFP 的量均高于单纯用肝细胞转化培养基进行培养。细胞ALB 免疫荧光检测显示，仅有加入培养过EPCs 上清液的实验组，在第7 天细胞产生ALB，且第9 天ALB 浓度增高。这均提示，随着诱导时间的延长，具有分泌AFP 的肝样细胞逐渐增多，因ALB 是成熟肝细胞所分泌，也提示MSCs 具有转化为成熟肝样细胞的潜能。本实验培养时间较短，培养观察诱导细胞9 d，实验组和模型对照组的AFP 均随时间的延长出现升高趋势，未见细胞成熟后AFP 产生减慢并逐渐降低的趋势，对后期EPCs 对MSCs 的转化影响尚未进行实验和观察；ALB 在实验组也已产生，并可见浓度逐渐增高的趋势，但因培养时间短，模型对照组细胞尚未见ALB的产生，可推断EPCs 可能在一定程度上促进了肝样细胞的成熟，但具体能起多大程度的促进作用，能使转化细胞的成熟加速多少，尚待进一步的研究。

综上所述，EPCs 在MSCs 向肝细胞转化中起一定促进作用，而EPCs 在MSCs 向肝细胞诱导分化中是通过何种机制参与还有待于进一步探索；其次EPCs 对MSCs 在向肝细胞转化的促进作用，也为细胞的联合培养、联合移植提供一种新的研究思路，为未来临床上联合干细胞加速细胞转化提供一定的理论依据。