史博文,刘铮铮,刘语,宋宁*

(1.西安国际医学中心麻醉手术中心,西安710075；2.西安交通大学药学院，西安710061)

碧桃(AmygdaluspersicaLinn. var.persicaf.duplexRehd.)属蔷薇科落叶小乔木，是优良的观赏树种之一，深受人们和园艺工作者的青睐。碧桃花，又名千叶桃花，是桃的变种，常见品种有白花碧桃、红花碧桃、垂枝碧桃、撒金碧桃等。《诗经》有载：“桃之夭夭，灼灼其华”。碧桃在中国已有3000多年的栽培历史，现在全国各地广泛栽培，主产于西北、华北、华东、西南等地区[1]。碧桃除具有较高的园林绿化价值外，它的食用、药用价值也为人类创造了许多财富。碧桃树干上汁液结胶形成的块状物俗称桃胶，不仅可食用，而且具有养阴生津，清泻虚热的作用[2]；其未成熟的果实称为碧桃干或桃奴，有收敛止汗之功[2]，还可治疗儿童营养性贫血[3]；由碧桃为主药组成的碧桃咳喘饮可防治急慢性支气管炎[4]。

目前，对碧桃的研究主要集中在栽培种植上[5-6]，对其化学成分和抗菌活性研究鲜有报道。同时，植物挥发油作为植物重要的次生代谢物质之一，具有抗菌、抗炎、抗氧化、安全等特点[7-9]，在医学、食品、香料、化妆品等方面具有广阔的应用前景。因此，本实验采用挥发油提取器法提取新鲜碧桃花中挥发油，并通过气相色谱-质谱联用方法进行成分分析，采用抗菌实验评价其体外抑菌活性，为进一步开发利用碧桃花挥发油提供理论依据。

β-葡萄糖苷酶是能够水解芳香基或烷基葡萄糖甙或纤维二糖的糖苷键的一类酶[10]，能将鲜花中如糖苷类等本身无香味、不挥发的物质水解，释放出潜在的香气成分，产生浓郁的具有天然特征香味的物质，起到自然增香的作用[11-12]。

本实验通过比较加入β-葡萄糖苷酶前后新鲜碧桃花挥发油化学成分变化研究β-葡萄糖苷酶对其增香作用，同时通过抗菌实验评价β-葡萄糖苷酶对其抑菌作用的影响。

1 材料与方法

1.1 材料、仪器与试剂

材料：新鲜碧桃花于2019年3月采自西安交通大学药学院的药园，由西安交通大学药学院牛晓峰教授鉴定为蔷薇科植物碧桃(AmygdaluspersicaLinn. var.persicaf.duplexRehd.)的花(黄色花)；大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、伤寒沙门氏菌，以上菌种由西安交通大学医学部微生物教研室提供。

仪器：GCMS-TQ8040型气相色谱-质谱联用仪(日本岛津公司)；AY120电子天平(日本岛津公司)；超净工作台(美国Thermo公司)；恒温培养箱(美国Thermo公司)；立式高压灭菌器(上海申安医疗器械厂)。

试剂：β-葡萄糖苷酶(上海源叶生物科技有限公司，100 U/g)；正己烷(上海阿拉丁生化科技股份有限公司，色谱纯)；无水硫酸钠(西安化学试剂厂，分析纯)；磷酸氢二钠(河南焦作市化工三厂，分析纯)；柠檬酸(成都化学试剂厂，分析纯)。

1.2 实验方法

1.2.1 β-葡萄糖苷酶水解反应。分别称取两份200 g新鲜碧桃花于250 mL pH 5.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液中，其中一份加0.5 g β-葡萄糖苷酶，另一份为空白对照。同时置于摇床中50 ℃恒温水浴5 h。

1.2.2 挥发油的提取。将β-葡萄糖苷酶水解前后的碧桃花分别置于2000 mL圆底烧瓶中，加水800 mL，沸石数粒，摇匀，按2015版《中国药典(四部)》挥发油测定法(通则2204甲法)提取挥发油，保持微沸5 h。收集所得挥发油，加入少量无水硫酸钠，静置。称取挥发油适量置于10 mL量瓶中，加正己烷溶解并稀释至刻度，待测(用于GC-MS分析)。称取新鲜碧桃花挥发油适量，临用前用无菌蒸馏水配成2.000、1.000、0.500、0.250、0.125、0.063、0.031、0.016 mg/mL溶液(用于抗菌试验)，未加β-葡萄糖苷酶处理所提取的碧桃花挥发油为挥发油(1)，加β-葡萄糖苷酶处理后提取的碧桃花挥发油为挥发油(2)。

1.2.3 气相色谱-质谱条件

1.2.3.1 气相条件：色谱柱为SHIMADZU SH-Rxi-5sil MS毛细管色谱柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；载气为氦气；进样口温度为250 ℃；分流比为5∶1；流速为1.0 mL/min；升温程序：初始温度60 ℃，保持3 min，以2 ℃/min速率升到120 ℃，再以3 ℃/min速率升到210 ℃，保持2 min，再以15 ℃/min升温至280 ℃，保持2 min；进样量：1 μL。

1.2.3.2 质谱条件：接口温度：250 ℃；离子源：EI；离子源电压：60 ev；离子源温度：230 ℃；质量扫描范围：45～550 m/z；溶剂峰切除时间：2.5 min，质谱检测起测时间：3.0 min。

1.2.4 最小抑菌浓度的测定。采用琼脂平板稀释法计算最低抑菌浓度(MIC)[13-14]。以环丙沙星为对照，将环丙沙星和碧桃花挥发油用无菌蒸馏水进行倍比稀释，制备系列浓度稀释液，然后用无菌吸管将稀释液分别定量加入到无菌培养皿中，与定量加入的培养基充分混匀，静置凝固后，制成含样品平板，按皿底的记号，在以上培养基上分别接种伤寒沙门氏菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌，移入培养箱中35～37 ℃培养24 h，观察细菌生长情况；另取一个稀释系列，不接种任何菌种作为对照，以完全没有菌生长的最低浓度作为碧桃花挥发油的最低抑菌浓度(MIC)。计算最小抑菌浓度(MIC)。

1.2.5 数据处理。所得的色谱和质谱信息经数据处理系统与其内存谱库(NIST)自动检索和解析，并用峰面积归一法测定了各化学成分在挥发油中的相对百分含量。抗菌实验数据采用SPSS 22.0软件进行统计学分析，显著性差异水平为0.05。

2 结果

2.1 新鲜碧桃花中挥发油成分分析

经GC-MS分析测得新鲜碧桃花中挥发油提取物的总离子流图如图1和图2所示。

图1 新鲜碧桃花挥发油的GC-MS总离子流图(无酶)

采用NIST标准质谱图数据库进行综合对比分析，由色谱峰面积归一化法计算各化学成分的质量分数，共鉴定出32种主要的挥发性化学成分，分析结果见表1。

注：*代表加β-葡萄糖苷酶组

由表1可知，新鲜碧桃花在分析鉴定出32种挥发性化学成分，主要有醇类(5种，占2.53%)，烯类(1种，占0.57%)，烷烃类(8种，占6.76%)，酚类(4种，占7.7%)，醛类(6种，占49.91%)，酮类(2种，占13.33%)，酯类(3种，占17.74%)，醚类(1种，占0.23%)芳烃类(1种，占1.02%)和酸类(1种，占0.21%)10类化合物。其中，醛类、酮类和酯类化合物相对含量较高，其主要成分为苯甲醛(48.92%)，苯甲酸苄酯(12.79%)，植酮(6.89%)，2-羟基-5-甲基苯乙酮(6.44%)，乙酸苄酯(4.68%)。醚类和酸类化合物含量较低。

通过表1的对比可知，在新鲜碧桃花中加入β-葡萄糖苷酶后香气成分的含量显著增加。加入β-葡萄糖苷酶后新增了2种化合物，分别为(-)-冰片和2,4-癸二烯醛，减少了1种化合物，为4-叔丁基-2,6-二异丙基苯酚。同时，反式-2,4-癸二烯醛、壬醛、苯甲酸乙酯、乙酸苄酯等化合物含量均增加，相对含量分别增加7.04%、0.24%、0.16%、2.57%，增长率达到4141.76%、137.40%、58.15%和54.86%，而苯甲酸苄酯、丁香酚、苯甲酸等化合物含量相对减少。

天然香料来自于动植物，但以植物为主。有研究表明[15]，香味成分与葡萄糖等结合成糖苷后，不具挥发性或挥发性很低，酶和化学方法分解这些糖苷能增加精油产量，对香气的形成起着重要的作用。碧桃花中许多化学成分可用作香料，在食品、化妆品、化工等行业应用广泛。冰片是龙脑香科植物龙脑香的树脂和挥发油加工品提取获得的结晶，广泛用于配制迷迭香、熏衣草型香精，并用于中药和中国墨中。丁香酚天然存在于丁香油、丁香罗勒油以及肉桂油等精油中，具有强烈的丁香香气和辛香香气，是调配香石竹花香的体香，用入有色香皂加香，也可用于辛香、木香和东方型、薰香型中，还可用于食用的辛香型、薄荷、坚果、各种果香、枣子香等香精及烟草香精中。反式-2,4-癸二烯醛GB 2760-1996规定为允许使用的香料，主要用于配制鸡肉香精及土豆片、柑橘、油炸品和香辛型食品。壬醛GB 2760-1996规定为暂时允许使用的食用香料，主要用于配制橙子、柠檬和白柠檬等型香精，用量极微。苯甲酸乙酯常用于配制香水香精和人造精油，也可用作食用香料。乙酸苄酯常用于配制茉莉型等花香香精和皂用香精。

加入β-葡萄糖苷酶后碧桃花中反式-2,4-癸二烯醛、壬醛、苯甲酸乙酯、乙酸苄酯等香精类成分含量大幅增加，同时新增了(-)-冰片和2,4-癸二烯醛2种化合物，说明β-葡萄糖苷酶可水解碧桃花香气前体物质，释放出碧桃花中潜在香气成分，对碧桃花有一定的增香作用。

2.2 抗菌实验结果

新鲜碧桃花挥发油对伤寒沙门氏菌等4种供试细菌的抑制实验结果如表2所示。

表2 新鲜碧桃花挥发油抗菌实验MIC值(mg·mL-1,n=3 )

由表2可知，新鲜碧桃花挥发油对伤寒沙门氏菌等4种供试菌具有明显抑制作用。挥发油(1)和挥发油(2)进行比较，挥发油(2)仍具有一定增加抗菌作用。说明经过β-葡萄糖苷酶处理后再提取的挥发油抗菌活性不变。

3 结论

通过建立碧桃花挥发油的GC-MS方法，共鉴定出32种挥发性化学成分，其挥发油的化学成分主要以醛、酮、酯类化合物为主。加入β-葡萄糖苷酶后反式-2,4-癸二烯醛等香精类化学成分含量大幅增加，说明β-葡萄糖苷酶能释放出碧桃花中潜在香气成分，对碧桃花有一定的增香作用，同时抗菌实验结果表明β-葡萄糖苷酶不改变其抗菌活性，为进一步开发和利用碧桃花资源提供了理论依据。