何月秀，王崟宁，曾维晶，李安顺，翟锐锐，李 娟，艾朝辉

(海南医学院 药学院，海南 海口 571199)

刺芫荽又称刺芹、洋芫荽、野芫荽、假芫荽、大叶芫荽、缅芫荽、阿佤芫荽等，伞形科刺芹属多年生草本植物。可用于治疗感冒寒咳、哮喘、胃气痛、产后出血、跌打损伤、肠炎腹泻、消化不良、胸痛、麻疹内陷、气管炎、急性传染性肝炎及蛇咬伤等症[1-4]。刺芫荽中含有多种天然产物，如多糖、黄酮、月桂醇等化合物；越来越多的研究表明天然多糖类化合物具有抗氧化、抗衰老、抗肿瘤及免疫增强作用[5]。然而迄今为止国内外对刺芫荽中多糖的含量和成分还没有报道过，刺芫荽作为一种可贵的药用植物资源，目前仅作为一种香料和调料食用，还没有被全面地开发利用[1]。因此，开发和利用刺芫荽多糖在现实生活中具有重要意义。本实验主要研究影响刺芫荽多糖提取的多种因素并优化提取工艺，建立刺芫荽多糖的测定方法。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

粉碎机，天津泰斯特仪器有限公司；恒温水浴锅，上海博讯生物医疗仪器有限公司；电子分析天平，瑞士METILER；TP电子天平，湘仪天平仪器设备有限公司；722型分光光度计，上海精密科学仪器有限公司。葡萄糖、浓硫酸、苯酚、无水乙醇等试剂均为分析纯，广州化学试剂公司；实验用水为蒸馏水；刺芫荽，采摘于海南地区，经鉴定为刺芫荽全草，干燥，粉碎至250～380 μm备用。

1.2 实验方法

1.2.1刺芫荽多糖提取工艺流程

准确称取1.0 g刺芫荽粉末于圆底烧瓶中，加入适量蒸馏水，于一定温度中水浴提取一定的时间，离心，取上清液，浓缩，再加入体积分数为75%乙醇使多糖沉淀，于冰箱中放置24 h后，再次离心得到刺芫荽多糖。

1.2.2标准曲线的绘制

准确称取100 mg标准葡萄糖于100 mL容量瓶中，加水至刻度，摇匀配置成1 g/L的标准溶液，依次吸取0.20、0.40、0.60、0.80、1.00、1.20 mL的葡萄糖标准溶液于6个25 mL的容量瓶中，并依次加入1 mL 6%的苯酚，5 mL浓硫酸，摇匀后静止30 min，加水定容，静置室温，以水为空白，于490 nm处测其吸光度。以横坐标为多糖浓度，纵坐标为吸光度，作标准曲线。得标准曲线A=6.291 5c-0.032，R2=0.997 1，表明在0.008～0.064 g/L有良好的线性关系。

1.2.3刺芫荽多糖的测定

将提取的多糖加入适量蒸馏水配制成多糖溶液。取2.00 mL的多糖溶液于25 mL容量瓶中，按1.2.2步骤加入1 mL 6%的苯酚，5 mL浓硫酸等操作，并于490 nm处测定吸光度，以标准曲线法计算多糖含量。

多糖提取率=c×V×D/W

式中：c，多糖的浓度，g/L；V，多糖溶液的体积，mL；D，稀释的倍数；W，刺芫荽粉末的质量，g。

1.2.4单因素考察

以料液比、提取温度、提取时间、提取次数4个因素进行单因素试验。

1.2.5正交实验

根据单因素试验结果，设计料液比、提取温度、提取时间、提取次数4个因素3水平的正交实验，确定刺芫荽多糖的最佳提取工艺条件。

1.3 方法学考察

1.3.1精密度试验

准确精密称取刺芫荽样品1.0 g，按1.2.1方法提取刺芫荽多糖及1.2.2方法于490 nm处连续6次测定吸光度。

1.3.2稳定性试验

准确称取刺芫荽样品1.0 g，按1.2.1方法提取刺芫荽多糖及1.2.2方法于490 nm处每隔30 min测定吸光度，连续测定3 h。

1.3.3重复性试验

分别称取6份1.0 g刺芫荽样品，按1.2.1方法提取刺芫荽多糖及1.2.2方法于490 nm处分别测定吸光度。

1.3.4加样回收率试验

分别称取6份1.0 g刺芫荽样品，并分别加入适量多糖标准溶液，按1.2.1方法提取刺芫荽多糖及1.2.2方法于490 nm处测定吸光度。

1.4 含量测定

分别称取3份1.0 g刺芫荽样品，按照优化后的提取工艺进行提取刺芫荽多糖及1.2.2方法于490 nm处测定吸光度。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果与分析

2.1.1料液比对多糖提取率的影响

在提取时间为90 min，提取温度为80 ℃。提取次数为1次，考察不同料液比对刺芫荽多糖提取率的影响，结果见图1。当料液比在(1∶10)～(1∶30)，刺芫荽多糖的提取率随着料液比的增大而不断提高，当料液比为(1∶30)～(1∶35)时，多糖提取率呈下降趋势。

图1 料液比对刺芫荽多糖的影响

2.1.2提取时间对刺芫荽多糖提取率的影响

在提取温度为80 ℃，料液比为1∶20，提取次数为1的条件下，考察不同的提取时间对刺芫荽多糖提取率的影响，结果见图2。提取时间为30～120 min时，刺芫荽多糖提取率的增加或减小幅度并不大，当提取时间为120～150 min时多糖提取率呈上升趋势，当提取时间>150 min时，多糖提取率下降。

图2 提取时间对刺芫荽多糖的含量的影响

2.1.3提取温度对刺芫荽多糖提取率的影响

在提取时间为90 min，料液比为1∶20，提取次数为1的条件下，考察不同提取温度对刺芫荽多糖提取率的影响，结果见图3。提取温度为60～75 ℃时，提取率呈上升趋势，75～85 ℃时提取率下降，85～90 ℃时提取率上升。考虑到温度过高容易破坏多糖的结构，影响提取率，综合各方面因素考虑，提取的最高温度设定为90 ℃。

图3 提取温度对刺芫荽多糖含量的影响

2.1.4提取次数对刺芫荽多糖提取率的影响

在料液比1∶20，提取时间为90 min，提取温度为80 ℃的条件下，考察不同提取次数对刺芫荽多糖提取率的影响，结果如图4所示。由图4可知，提取2次比只提取1次的提取率要高，提取3次与提取2次相比，提取率并没有升高。

图4 提取次数对刺芫荽多糖含量的影响

2.2 正交试验优选

在单因素考察的基础上，取刺芫荽粉末1.0 g，以多糖提取率为指标，对料液比、提取时间、提取温度及提取次数进行正交试验，每个因素选3个水平，按L9(34)正交设计进行试验。选择的因素水平见表1，L9(34)正交试验设计见表2。

表1 正交试验因素水平

表2 刺芫荽多糖提取正交试验安排及结果

由表2可知，四个因素对刺芫荽多糖得率影响的主次顺序依次为：提取次数>提取时间>料液比>提取温度。刺芫荽多糖的最佳工艺组合为A1B3C3D2，即在料液比为1∶20，提取时间为150 min，提取温度为80 ℃，提取两次刺芫荽多糖的得率为12.78 mg/g。

2.3 方法学考察

2.3.1精密度试验

测得的吸光度值分别为0.269、0.270、0.269、0.268、0.268、0.267，RSD=0.39%(n=6)。表明该方法具有较高的精密度。

2.3.2稳定性试验

测得的吸光度值分别为0.267、0.275、0.271、0.273、0.269、0.264，RSD=1.49%(n=6)。结果表明该实验提取的刺芫荽多糖溶液在3 h内较为稳定。

2.3.3重复性试验

测得的吸光度值分别为0.271、0.272、0.267、0.270、0.269、0.269，RSD=0.66%(n=6)，表明该方法具有较好的重复性，方法可靠。

2.3.4加样回收实验(见表3)

表3 加样回收实验结果

2.4 含量测定

按正交优化的提取工艺条件提取刺芫荽多糖3份样品并按1.2.2方法测定吸光度，计算刺芫荽多糖含量分别为12.83、13.34、13.18 mg/g。

3 结语

用正交法优化刺芫荽多糖的提取工艺，得到的最优提取工艺为料液比1∶20、提取时间150 min、提取温度80 ℃、提取2次，使刺芫荽多糖得到充分地提取，再经离心、浓缩、醇沉再离心等步骤得到刺芫荽多糖。按该工艺条件下多糖得率为12.78 mg/g。

采用苯酚-硫酸法对刺芫荽多糖含量进行测定，其原理是多糖在硫酸的作用下先水解成单糖，并迅速脱水生成糖醛衍生物，然后与苯酚生成橙黄色化合物。再以比色法测定，并对此测定方法进行了重复性、稳定性、精密性及加样回收率考察，考察结果令人满意，说明用苯酚-硫酸法测定多糖方法简单可行、稳定、可靠，可用于刺芫荽多糖的含量测定[5]。