不同类型苍术主要遗传性状的比较研究

2020-06-10李巧玲韩如刚张万超林茂祥

中国野生植物资源 2020年5期

韩凤，肖忠，李巧玲，刘杰，韩如刚，李娟，张万超，林茂祥*

(1.重庆市药物种植研究所，重庆南川 408435； 2.重庆市中药良种选育与评价工程技术中心，重庆南川 408435)

苍术(Atractylodeslancea(Thunb.) DC.)为菊科多年生草本植物，以干燥根茎入药，在我国具有悠久的药用历史，为传统大宗药材之一，具有祛风散寒、燥湿健脾、明目等作用[1]。主产于江苏、浙江、山东、江西、广东、安徽、湖北、四川等地区[2-3]。长期以来，苍术在生产上以种子繁殖和根茎繁殖为主，一般由药农自繁、自留或者在采挖时剪取根茎分株，没有进行系统的人工选种留种，导致后代群体良莠混杂，植株性状参差不齐，出现多种变异类型[4-5]，随着苍术种植范围不断扩大，经过长期的互相引种、交流，大田中苍术表现出多种栽培类型[6]。从形态上可见，同一居群内表现多种植株类型：分支的有无、叶片宽窄、分裂程度以及叶柄有无等，造成类型混杂，再加上连作障碍现象十分普遍，导致种质退化、抗逆性差，引起减产，导致药材质量不稳定，这些为苍术的生产及选育带来了很大困难。因此，本研究对6种不同叶片类型的苍术进行了形态学性状、产量和抗病性以及品质的比较研究，以期为苍术的遗传分化、植株优选、定向株型培育及开发利用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

同一生长期采集植株茎干距离地面15 cm的叶片(裂叶不采集)，叶形根据叶片长宽比、叶片质地、茎干等划分为6类，分别为长椭圆形(A)、卵圆形(B)、倒卵形(C)、长披针形(D)、披针形(E)、宽线形(F)。

图1 不同类型苍术Fig.1 Different types of A. lancea

1.2 方法

对上述苍术进行初步调查后，2016年12月27日将以上6个苍术种质资源种植在重庆市南川区三泉镇马嘴村的中药材试验地上，土质为砂壤土，肥力中等。土壤基本理化性质：有机质含量5.98 g/kg，速效氮149.64 mg/kg，速效磷37.49 mg/kg，速效钾134.88 mg/kg，pH 6.57。试验田周边设置保护行，试验地做成1.3 m宽的畦，采用随机区组设计，各类型设3次重复，株行距为25 cm×30 cm，厢沟深30 cm。

于2018年8月初对苍术农艺性状进行测定，每一种质资源在中间两行连续取20株，分别调查株高、茎粗、叶长、叶宽、叶面积、主枝数、叶形指数、茎干颜色等。11月初采挖苍术根茎，测量根茎相关性状和产量。取不同类型的苍术样品置干燥箱中30℃恒温干燥后，除尽泥沙和杂质，粉碎过100目筛备用。参照2015年版《中国药典》高效液相色谱法测定[1]。

2018年5月～2018月10月调查发病叶片数及叶片病斑面积。根据王铁霖等[7]所报道的苍术常见病害，每个类型在小区(15行×4列)的第二、三列植株中，采用“之”字形取样，调查叶片发病情况，记录各级病叶数(表1)。病叶率、病情指数计算公式如下:

ML=∑ F/N×100%；
DI=∑(F×n)/(N×5)×100；
RDI= DI / max(DI)；
RRI= 1-RDI；

其中：ML表示病叶率，DI表示病情指数，RDI表示相对病情指数，RRI表示相对抗性指数，F表示每一病害级别的叶片数，n 表示病害级别，N 表示调查的总叶片数。

表1 叶部病斑分级标准

苍术根部病害的调查，取样同一地块不同类型苍术，每个类型在小区(15行×4列，3个重复)的植株中，每重复按奇数行取奇数列、偶数行取偶数列的方式取样(共计15株)，记录所有被调查植株的根部发病情况，参考方仲达[8]的方法，并根据苍术根部病害的实际发病统计结果制定苍术根部病害的分级标准(表2)。

表2 苍术根部病害分级标准

以病情指数为基础，采用相对抗病性方法评价其抗病程度(抗病级别)[9-10]，根据相对抗性指数进行抗性划分：免疫(1.0)，抗病(0.60～0.99)，较抗病(0.40～0.59)，较感病(0.20～0.39)，感病(<0.20)。

根据马小军等[11]的方法，依据苍术生产中各项指标的重要性，用综合指数表示不同类型种质的优劣，由产量、品质和抗病性3个一级指标构成，权重分别设为40%、40%、20%，总分为100分。

HI = EY / BY × 100%
A = HI × MP × CR × DR；
OIS = A / max(A) × 40
QIS = CA / max(CA) ×40
DRIS = RRI / max(RRI)×20
CES = OIS + QIS + DRIS

其中：HI为收获指数，EY为经济产量(每株药材产量)，BY为生物产量(每株总干重)，MP为平均亩产量，CR为商品率，DR为折干率，OIS为产量指标得分(分)，QIS为品质指标得分(分)，CA为苍术素含量，DRIS为抗病指标得分(分)，RRI 为相对抗性指数，CES为综合评比得分(分)。

1.3 数据分析

试验数据采用EXCEL 2010和DPS 7.05软件进行处理和统计分析。

2 结果与分析

2.1 不同类型形态性状变异

形态学性状的观测和描述是种质资源研究的最基本方法和途径[12]，根据所测定的指标，计算叶片数、叶长、叶宽、叶面积、叶形指数、株高、主枝数、茎干直径、茎叶鲜重芽头个数、须根鲜重、根茎干重、根茎鲜重、根茎直径、折干率等共15个形态学性状指标的平均值。由于各平均值的大小不同，为比较不同类型间的差异，揭示各性状的变异强弱，计算出相关农艺性状的变异系数，见表3。

由表3可知，从苍术不同类型间的各性状表现来看，各指标的平均变异系数较大，差异最大的为芽头个数，平均变异系数为41.57%，其次须根鲜重为33.63%，叶形指数最小为6.64%。各性状平均变异系数从大到小依次为：芽头个数>须根鲜重>根茎干重>根茎鲜重>根茎直径>株高>主枝数>茎干直径>茎叶鲜重>叶面积>叶片数>叶长>叶宽>折干率>叶形指数，15个苍术农艺性状变异系数大，表明苍术资源类型丰富，有利于种质材料的比较和筛选。可以看出，同一类型内各植株之间植物学性状的主要变异来源于芽头个数、须根鲜重、根茎干重、根茎鲜重等指标；但叶面积、叶片数、叶长、叶宽、叶形指数、折干率等各性状指标的平均变异系数相差相对较小，表明各类型之间的农艺性状变异较为明显，这为苍术的优良类型筛选提供了丰富的种质资源。

从苍术不同类型内的各性状表现来看，各性状指标的平均变异系数均较大，重量差异最大的为根茎干，平均变异系数为17.12%，其次根茎鲜重为16.05%，根茎直径最小为3.10%。各性状的平均变异系数从大到小依次为：根茎干重>根茎鲜重>叶面积>叶长>叶宽>茎叶鲜重>须根鲜重>芽头个数>主枝数>株高>叶片数>叶形指数>折干率>根茎直径。可以看出，不同类型内农艺性状的主要变异来源于根茎干重、根茎鲜重、叶面积、叶长、叶宽等指标，各性状指标的平均变异系数相差较不大，表明不同类型内苍术植株之间性状较为稳定。

表3 不同类型苍术种质资源形态观测及变异系数

注：“C.V.”表示变异系数。

2.2 不同类型苍术农艺性状间的相关关系

由于农艺性状之间存在复杂的关系，它们对选育优良品种(类型)有重大影响。将所测6个类型的15个农艺性状指标数据，通过DPS7.05软件计算相关系数(表4)。由表4可以看出，叶宽和叶面积、根茎鲜重、根茎干重、折干率呈极显著正相关，相关系数R分别为0.905、0.948、0.945、0.930，表明叶宽的大小直接影响产量，因为叶片的大小对光能利用、水分蒸发量、干物质积累等有着显著的影响，因此，叶宽、叶面积是重要的农艺性状，可作为苍术优良类型筛选的重要依据。根茎直径和根茎鲜重、根茎干重、折干率呈极显著正相关，相关系数R分别为0.936、0.938、0.924，表明根茎直径也影响苍术的产量；叶片数和叶形指数、叶宽和根茎直径、叶面积和根茎直径、根茎鲜重、根茎干重、折干率呈显著正相关，这为评价苍术药用部位地下根茎提供了极为重要的参考依据；叶宽与叶形指数呈极显著负相关；叶片数和叶宽，叶形指数和根茎鲜重、根茎干重、折干率，茎叶鲜重和须根鲜重呈显著负相关。

2.3 聚类分析

对数据进行标准化后，采用欧式距离方法算出6个类型15个主要农艺性状之间的欧式距离。根据不同类型苍术的欧式距离，绘制成系统聚类图(图2)，图中的6个类型的顺序依次是A、D、E、F、B、C类型。不同类型的15个主要农艺性状聚类分析结果与作者对苍术形态性状指标观察分析后的结果一致，体现了苍术不同类型内的相似程度。当欧式距离为51.7918时，可将6个类型聚为二大类，B、C类型聚为一类，A、D、E、F类型聚为一类，当欧式距离为23.2876时，D、E类型聚为一类，说明其亲缘关系较近，遗传相似度较高，说明两者与其他类型苍术相似度较低，值得进一步探讨。

图2 聚类分析树状图(D2=51.7918)Fig.2 Dendrogram of cluster analysis morphology marker

表4 苍术农艺性状的相关性

注：*表示差异显著(P<0.05)，**表示差异极显著(P<0.01)。

2.4 不同类型苍术病害

2.4.1 不同类型苍术的抗病性

抗病性调查是进行人工优良选种的必不可少的因素之一[9]。在田间自然发生条件下，分别对不同类型苍术主要病害发生进行了调查。由表5可知，其中灰斑病和根腐病生生相对较重，病叶率为30.0%～55.0%，病情指数为16.7～40.4，此两种病为危害茅苍术的主要病害。总体来说，茅苍术的黑斑病危害相对较轻，病情指数为4.2～25.2，平均为10.39。不同类型苍术灰斑病抗性由强到弱的顺序依次为A>F>C>D>E>B，轮纹病抗性由强到弱的顺序依次为F>A>C>D>E>B，黑斑病抗性由强到弱的顺序依次为F>A>C>E>B>D，根腐病抗性由强到弱的顺序依次为A>C>B>E>F>D，白绢病抗性由强到弱的顺序依次为F>E>C>B>A>D。5种苍术病害在6个类型中均有不同程度的病害发生，说明病害发生具有普遍性，未发现免疫品种。此外，在大田调查中，苍术同一植株上表现出不同的叶部病害(图3-A)，同一叶片上同时被两种以上病害侵染(图3-B～E)，表明苍术叶部各病害多存在复合侵染现象。

表5 不同类型苍术对5种病害的田间抗性

图3 同一植株上不同的叶部病害和同一叶片不同病害症状Fig. 3 Different leaf diseases on the same plant and different disease symptoms on the same leaf

2.4.2 不同类型苍术对病害的综合抗性比较

将不同类型苍术各病害的病情指数相加，取其平均数，计算相对抗性指数，得出其抗病级别，结果见表6。对苍术叶部常见的灰斑病、轮纹病、黑斑病和根部根腐病和白绢病等5种病害的病情指数进行统计分析，不同类型的平均病情指数在12.1～24.1范围内。按照病情指数、相对抗性指数的大小[13-14]，将6个类型的病害综合抗病性分为较抗病、较感病和感病3级。6个苍术类型中没有发现免疫类型；有3个较抗病品种A、C、F类型，占总品系的50.0% ；1个较感病品种E类型，占总品系的16.7%；2个感病品种B和D类型，占总品系的33.3%。

表6 不同类型苍术种质资源对病害的综合抗性统计

2.5 不同类型苍术主要指标成分(苍术素)含量

参照2015年版《中国药典》的方法，精密吸取供试品溶液10μL，注入液相色谱仪(LC-6AD，日本津岛公司)，采集 0～25min的图谱，样品中苍术素与其他组分的色谱峰分离较好(见图4)。不同类型苍术的苍术素含量存在一定差异(表7)，以A类型的苍术素含量最高，达0.4049%，与其它类型达显著差异(P<0.05)。F类型次之，达0.3205%；再次之为B类型，为0.3131%；D类型，为0.3038%；C类型，为0.2126%；E类型最低，仅为0.2077%。C和E类型之间在苍术素含量上没有显著差异(P>0.05)。

图4 苍术高效液相色谱图Fig. 4 The HPLC chromatogram of A. lanceaA：对照品；B：苍术样品色谱图 (1，苍术素)

表7 不同类型苍术苍术素的含量

Table 7 Atractylodesin contents of different types of A. lancea

不同类型总灰分(%)苍术素含量(%)A5.910.4049±0.0015aB5.590.3131±0.0025cC5.370.2067±0.0022eD5.220.3083±0.0028dE5.930.2077±0.0020eF5.900.3205±0.0027b

注：同一列不同小写字母表示处理间差异显著(P<0.05)。

2.6 不同类型苍术综合评价

从表8可以看到，不同类型在产量特性上有较大差异，从产量的二级指标来看，以A、B类型的数值较高。产量指标的综合评比得分结果也得到很好的印证，以A类型得分最高，满分40分；B类型次之，为35.47分；往后E类型为28.67分，C类型为23.01分，D类型为16.77分，F类型最低为10.32分。不同类型在抗病性方面，不同品系加权评价后的抗逆性总得分值有明显的差异。A类型相对抗性指数高，为满分20分；其次，F类型得分17.60分；依次为C类型得16.40分，E类型得11.60分，B类型得5.2分，D类型不得分。苍术素作为苍术品质分析的指标，A类型的苍术素含量最高，其加权得分也最高，为满分40分；其次为F类型，为31.66分；以后依次为B类型30.93分，D类型30.46分，E类型20.52分，C类型20.42分。

对不同类型从产量、品质和抗病性这三方面进行综合的加权打分评价后得出综合得分，A类型综合得分最高，为100分；其后依次为B、E、C、F和D类型，得分分别为71.60、59.83、59.58和47.23，说明不同类型苍术之间存在一定的差异。每一个指标均是A类型得分最高，因此综合评比得分也最高，为6种类型苍术中综合性状表现最好的类型。去除第一的A类型外，三个指标第二到第六的排名却不一致。

表8 不同类型苍术产量、抗病性、品质综合得分比较

3 讨论

形态学性状既有变异性又具有稳定性，受其本身的遗传组成和所处生态环境两方面影响，是生物适应其生存环境的表现形式[15]。苍术经过长期自然选择和异花授粉的影响，不同类型苍术形态学性状平均变异系数为6.64%～41.57%，说明苍术具有丰富的形态性状变异[4,5]，且不同性状的差异不同。这种差异主要来自芽头个数、须根鲜重、根茎干重、根茎鲜重、根茎直径等，这是环境因素对性状的选择性，即不同的性状对生境因子影响的反应。这既与遗传因素有关，也与环境影响密不可分。但叶长、叶宽、叶形指数的变异系数较小，这可作为优良类型性状稳定性的选择。利用植物形态学特征的差异进行种下分类，是一种简单有效的方法[16,17]。将6个类型的15个主要农艺性状进行聚类分成两大类，其结果与苍术形态性状指标观测分析结果相似，体现了苍术不同类型的遗传的稳定性。因此，通过对植物遗传稳定性、变异规律性的形态学性状进行比较，能为植物的分类研究提供大量的有利证据[18]。

抗病性调查是评价抗病性的重要指标之一，也是抗病育种的基础工作，可为抗病育种提供可靠的科学依据[9,14]。通过对不同类型苍术病虫害情况的调查，初步摸清了重庆地区苍术的主要病害有根腐病、白绢病、灰斑病、轮纹病、黑斑病等5种，而多数病害的发生与环境、气候、病(虫)源和种质等方面都密切相关。在本试验中选定不同类型的苍术作为特定病害的参考依据，以利于更准确地检测其抗病性。结果表明，不同苍术类型对不同病害的抗性不同，A、F和C类型的抗性相对其他3个类型较强，其中E类型为较感病，B和D两个类型为感病。本试验仅在自然发生条件下进行了病害观察、调查和田间抗病性评价，后续研究应在人工接种单一病原条件下，对已有不同类型苍术进行抗性筛选，以期挖掘和利用优良类型，从而进一步提升选育品种的抗性，为防治苍术根腐病、白绢病、灰斑病、轮纹病、黑斑病提供优良的种质资源。

药用植物作为一类具有医疗保健价值的特殊用途植物，其指标成分是评价药材品质和筛选核心种质的主要依据之一。苍术素不仅在苍术药用价值中发挥了重要作用，也是苍术质量评价的标准[19]。由于苍术的成分比较复杂，含有种类较多，本试验参考2015年版《中国药典》高效液相色谱法来测定其含量。有四个类型苍术药材中的苍术素含量达到2015年版《中国药典》0.3%的规定，有两个类型未达到最低标准，在生产中可逐渐淘汰这两个类型。

加权评价应用了模糊集理论进行决策制定，其目的是在具有多个因子的模糊决策环境中，为不同的因子赋予相应的权重值，给与测评的对象提供一种相对科学、可靠的综合评价[20-21]。参照马小军等[8]的方法，根据生产中苍术各项指标的重要性，选择了产量、抗病性和品质三个指标，采用加权打分评价方法对苍术不同栽培类型进行综合评价。分别赋予不同的权重，再计算出综合得分，以此表示不同类型的优劣。该方法较为全面、科学的反映了不同类型苍术的优劣，是目前苍术种质较合理的评价方法和模式。