潘 姝，文丹宁，李华东

(武汉市金银潭医院 感染科, 湖北 武汉 430000)

肺泡上皮细胞位于肺泡表面，是抵御外界病原体的重要屏障，与肺部疾病的发生发展息息相关[1]。肺泡上皮细胞凋亡可破坏肺上皮细胞的完整性，促进急性肺损伤发生；而抑制其凋亡在改善急性肺损伤方面发挥着积极作用[2]。因此，探讨肺泡细胞凋亡的分子机制，寻找抑制其凋亡的有效靶点对改善急性肺损伤具有重要意义。微小RNA(miRNA)是广泛存在于真核生物体中的短链非编码RNA，通过与靶基因特异性结合抑制其表达，在细胞增殖、分化和凋亡等过程中发挥着重要作用。miR-29b是一种与肺癌、肺纤维化和肺炎等肺相关疾病密切相关的miRNA[3-5]，但其在肺泡上皮细胞凋亡中的作用并不完全清楚。细菌内毒素脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)是构成革兰阴性细菌细胞壁外膜的主要成分，可诱导的肺泡上皮细胞凋亡，引起急性肺损伤[6]。本研究以肺泡上皮细胞系A549为研究对象，观察miR-29b对LPS诱导的A549细胞凋亡的影响，并探讨其可能的分子机制，以阐明miR-29b在肺泡上皮细胞凋亡中的作用。

1 材料与方法

1.1 细胞及试剂

人肺泡Ⅱ型上皮细胞系A549(中科院上海细胞库)，LPS(Sigma-Aldrich公司)；GAPDH、Bcl-2、Bax和cleaved caspase-3抗体(Cell Signal Technology公司)； Lipofectamine 2000和Trizol试剂(Invitrogen公司)；胰蛋白酶、胎牛血清和高糖DMEM培养基(Gibco公司)； RIPA裂解液、荧光素酶报告基因检测试剂盒、annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒和BCA蛋白检测试剂盒(上海碧云天生物技术研究所)；MTT试剂、辣根过氧化酶标记的二抗和RT-qPCR试剂盒(北京索莱宝科技有限公司)；PCR引物序列(上海生工生物工程有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞的培养、分组与处理： 使用高糖DMEM培养基(含10%胎牛血清)在5% CO2的37 ℃恒温培养箱中常规培养A549细胞，定期(每2 d)换液，待细胞汇合度达85 %左右时，以胰蛋白酶消化并按照1∶3比例传代培养。将良好的第4代增殖期的A549细胞接种至细胞板上，于培养箱中培养过夜。将细胞分为1)对照组：未处理；2)LPS组：给予10 mg/L的LPS处理24 h[7]；3)LPS+miR-NC组：转染miR-29b mimics阴性对照后给予10 mg/L的LPS处理24 h；4)LPS+miR-29b组：转染miR-29b mimics 后给予10 mg/L的LPS处理24 h。待细胞汇合度达75 %左右时，参照Lipofectamine 2000说明书步骤将miR-29b mimics及其阴性对照根据上述分组转染至A549细胞中。转染24 h后，给予LPS处理。孵育24 h后，采用RT-qPCR检测各组细胞中miR-29b的表达水平以评价转染效果。

1.2.2 RT-qPCR检测miR-29b的表达：用Trizol法提取A549细胞总RNA，运用紫外分光光度计检测总RNA的浓度。根据RT-qPCR试剂盒说明书步骤将RNA反转录成为cDNA，在以cDNA为模板，配制20 μL的反应体系，按照设定的反应程序(95 ℃预变性2 min；95 ℃变性40 s、58 ℃ 退火40 s、72 ℃延伸 40 s，38个循环)上PCR仪进行扩增。以U6为内参，运用2-△△Ct法比较各组细胞中miR-29b表达水平。实验重复3次。

1.2.3 MTT法检测细胞存活率：将A549细胞以每孔100 μL(3×105个/mL)接种至96孔细胞板上，在培养箱内常规培养过夜。处理结束后，加入20 μL/孔 MTT溶液(5 g/L)孵育4 h。弃上清后，加入150 μL/孔二甲基亚枫振荡反应至结晶溶解。采用酶标仪在570 nm波长处检测各组细胞的吸光度值，并根据公式：存活率(%)=(处理组吸光度值-空白组吸光度值)/(对照组吸光度值-空白组吸光度值)×100%计算出各组细胞的存活率。实验重复3次。

1.2.4 流式细胞仪检测细胞凋亡率：采用0.25%胰蛋白酶消化1.2中处理结束后的细胞，使用磷酸缓冲液洗涤两遍后，加入500 μL结合缓冲液悬浮细胞，再依次加入annexin V-FITC 和PI工作液各5 μL，充分混匀后，于室温避光条件下反应10 min。60 min内上流式细胞仪检测各组细胞的凋亡率。实验重复3次。

1.2.5 Western blot检测Bcl-2、Bax和cleaved caspase-3蛋白的表达：使用RIPA细胞裂解液提取细胞总蛋白，并以BCA法定量总蛋白的浓度与纯度。将蛋白样品与等体积的上样缓冲液混匀后，置于沸水浴中变性5 min。以60 μg/孔上样至12% SDS-PAGE凝胶中进行电泳，结束后转至PVDF膜。使用5%脱脂奶粉封闭1 h后，加入Bcl-2(1∶500)、Bax(1∶800)、次leaved caspase-3(1∶1 000)和GAPDH(1∶1 000)一抗工作液在4℃下孵育24 h。经TBST缓冲液洗涤15 min×3次后，加入辣根过氧化酶标记的二抗工作液(1∶2 000)于室温下孵育1 h。滴加ECL化学发光剂于暗室内显影曝光后，采用凝胶成像系统扫描分析目的蛋白条带的吸光度值，并以目的条带吸光度值与内参GAPDH蛋白条带的吸光度值的比值表示目的蛋白的相对表达水平。实验重复3次。

1.2.6 双荧光素酶报告基因实验：分别构建含Bax 3′UTR野生结构(野生型Bax-WT)和Bax 3′UTR突变结构(突变型Bax-MUT)的Bax 3′UTR 荧光素酶报告载体。将A549细胞以适当密度接种至6孔细胞板上后，细胞培养箱内培养至70%汇合度时，参照Lipofectamine 2000说明书步骤将miR-29b mimics及其阴性对照分别与Bax-WT、Bax-MUT进行共转染，并标记为miR-29b+Bax-WT组和miR-29b+Bax-MUT组、miR-NC+Bax-WT组和miR-NC+Bax-MUT组。转染48 h后，收集各组细胞，参照荧光素酶报告基因检测试剂盒说明书步骤检测其荧光素酶活性。实验重复3次。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 转染后A549细胞中miR-29b表达升高

给予LPS处理的LPS组、LPS+miR-NC组和LPS+miR-29b组细胞中miR-29b的表达水平较对照组明显降低(P<0.05)；与LPS组相比，LPS+miR-29b组细胞中miR-29b的表达水平明显升高(P<0.05)(表1)。

*P<0.05 compared with the control group;#P<0.05 compared with LPS group.

2.2 miR-29b过表达对A549细胞活力的影响

与对照组相比，LPS组、LPS+miR-NC组和LPS+miR-29b组中细胞存活率均明显降低(P<0.05)；与LPS组相比，LPS+miR-29b组细胞存活率明显升高(P<0.05)(表2)。

表2 各组细胞的存活率和凋亡率

*P<0.05 compared with the control group;#P<0.05 compared with LPS group.

2.3 miR-29b过表达对A549细胞凋亡的影响

与对照组相比，其余3组细胞凋亡率均明显升高(P<0.05)；LPS+miR-29b组细胞凋亡率较LPS组明显降低(P<0.05)(图1,表2)。

图1 流式细胞仪检测各组细胞凋亡情况Fig 1 Apoptosis in each group was detected by flow cytometry

2.4 miR-29b过表达对A549细胞凋亡相关蛋白表达的影响

与对照组相比，LPS组、LPS+miR-NC组和LPS+miR-29b组细胞中Bax和cleaved caspase-3蛋白的表达水平明显升高，而Bcl-2蛋白的表达水平明显降低(P<0.05)；与LPS组相比，LPS+miR-29b组细胞中Bax和cleaved caspase-3蛋白的表达水平明显低于LPS组，而Bcl-2蛋白的表达水平明显高于LPS组(P<0.05)(图2,表3)。

图2 Western blot检测Bcl-2、Bax和cleaved caspase-3蛋白的表达Fig 2 Expression of Bcl-2, Bax and cleaved caspase-3 proteins were detected by Western blot

2.5 miR-29b靶基因的预测及其验证

采用TargetScan(http://www.targetscan.org/)、miRanda(http://www.microrna.org/microrna/home.do)及miRBase(http://mirbase.org/)三大数据库预测到Bax 3′UTR 与miR-29b存在互补的核苷酸序列(表4)。采用双荧光素酶报告基因实验检测得到：miR-29b+Bax-WT组细胞的荧光素酶活性较miR-NC+Bax-WT组明显降低(P<0.05)(表5)。

3 讨论

miR-29b可通过TGF-β/Smad信号通路抑制肺间质纤维化过程[4]。miR-29b的表达与支气管肺发育不良严重程度相关，可通过降低母体炎性反应和新生儿高氧血症小鼠的基质蛋白表达改善肺泡极化，与急性肺损伤和肺纤维化关系密切[8]。在H2O2诱导的高氧性急性肺损伤模型中，在筛选肺泡上皮细胞凋亡相关miRNA时发现miR-29b表达明显降低[9]，但miR-29b在肺泡上皮细胞凋亡中的调控作用及其机制尚不明确。

表3 各组细胞中Bcl-2、Bax和cleaved caspase-3蛋白的表达水平

*P<0.05 compared with the control group;#P<0.05 compared with LPS group.

表4 Bax 3′UTR 与miR-29b的结合位点Table 4 Binding sites of Bax 3′UTR to miR-29b

表5 各组细胞的荧光素酶活性

*P<0.05 compared with miR-NC+Bax-WT group.

本研究用LPS处理后发现，肺泡上皮细胞A549存活率降低，凋亡率升高，同时细胞中抑凋亡蛋白Bcl-2的表达水平降低，而促凋亡蛋白Bax和Cleaved caspase-3的表达水平升高，表明LPS可通过调控Bcl-2、Bax和Cleaved caspase-3蛋白的表达诱导肺泡上皮细胞凋亡。此外，LPS可引起A549细胞中miR-29b表达降低。该结果与报道[10]的在LPS诱导人腹膜间皮细胞发生上皮细胞间充质转化的研究中发现LPS可下调miR-29b表达的结果相似。提示，miR-29b可能在LPS诱导的细胞凋亡过程中发挥着重要作用。

miR-29b可通过抑制成神经细胞瘤细胞N2a凋亡减轻糖剥夺/再灌注损伤[11]。miR-29b可通过调控SP1表达在白藜芦醇抗糖尿病大鼠视网膜细胞凋亡过程中发挥着积极作用[12]。本研究成功上调A549细胞中miR-29b的表达后发现，LPS刺激的A549细胞存活率和Bcl-2蛋白的表达升高，凋亡率和Bax、Cleaved caspase-3蛋白的表达降低。提示miR-29b可抑制LPS诱导的肺泡上皮细胞凋亡。

采用生物信息学软件预测miR-29b的潜在靶基因，最终将Bax作为研究对象。Bax是公认的促凋亡基因，属于Bcl-2家族成员，其编码的蛋白可与Bcl-2形成异二聚体抑制Bcl-2的作用，进而在细胞凋亡过程中发挥着促进作用。在LPS诱导的急性肺损伤肺组织中Bax的表达升高[13]，沉默Bax表达可逆转TNF-α诱导肺泡上皮细胞凋亡[14]。采用双荧光素酶报告基因实验证实Bax是miR-29b的靶基因；上调miR-29b表达后，A549细胞中Bax蛋白的表达水平降低。miR-29b通过直接靶向Bax抑制阿霉素诱导的心肌细胞凋亡[15]。这提示，miR-29b可能通过靶向调控Bax表达抑制LPS诱导的肺泡上皮细胞凋亡，进而改善LPS诱导的急性肺损伤。

总之，miR-29b可抑制LPS诱导的肺泡上皮细胞系A549凋亡，其作用机制可能与靶向调控Bax表达有关。