李雅惠，李 凯，罗艳云，李梦真，邙新雨，宋 伟，杨 涛*

(1.山西医科大学 生物化学与分子生物学教研室， 山西 太原 030001；2.中国医学科学院基础医学研究所 北京协和医学院基础学院 医学分子生物学国家重点实验室， 北京 100005)

精子发生(spermatogenesis)是指精原细胞在雄性生殖腺(睾丸)的曲细精管中经过一系列分裂、分化最终形成成熟精子的过程，可分为有丝分裂期、减数分裂期和精子形成期3个时期[1-2]。精子发生的每个时期均受到特异基因的表达调控[2]，所以了解每个时期的特异调控基因，有助于更好的实现对雄性生殖不育的基因治疗。

Dazl(deleted in azoospermia-like) 基因属于DAZ(deleted in azoospermia)基因家族的成员之一，在人和小鼠物种中高度保守。在小鼠睾丸组织中，Dazl基因特异表达于生精细胞中，Dazl基因的缺失，会导致减数分裂异常，造成雄性小鼠不育[3-4]。

目前，基因治疗是治疗雄性生殖不育极具潜力的技术，但用于雄性生殖不育的基因治疗的载体启动子主要是CMV，CMV为组成型启动子，在组织中广泛表达，特异性不强。为了使基因治疗更加具有目的性，使目的基因在生精细胞中特异表达，本研究尝试将载体上的广谱启动子替换为生精细胞特异启动子，构建了含有小鼠生精细胞特异启动子Dazl的真核表达载体AAV-Dazl-RFP-Flag。使Dazl基因启动子能够在生精细胞中特异性启动RFP，从体内、外验证Dazl基因的启动子在生精细胞中的启动效果，为基因治疗提供更加高效的载体工具。

1 材料与方法

1.1 材料

小鼠精原细胞系GC1 spg、HEK-293T细胞、腺病毒转化的人胚肾细胞AAV-293(本课题组保存)；真核表达质粒AAV-CMV-RFP-Flag、AAV包装辅助质粒(本实验室保存)；DMEM高糖培养基(Corning公司)；胎牛血清、opti-MEM Reduced serum medium (Gibco-BRL公司)；Q5 High-Fidelity 2X Master Mix、NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix(NEB公司)；5×上样缓冲液、1 kb DNA ladder (GENERay公司)；FastDigestMluⅠ、LipofectamineTM3000 Transfec-tion Reagent、RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit、PowerUp SYBR Green Master Mix(Thermo Fisher Scientifical 公司)；BamHⅠ(TaKaRa公司)；普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(康为世纪生物科技有限公司)；引物(合成于北京擎科生物科技有限公司)(表1)；anti-Flag、Poly(ethylene glycol)、optiPrepTMDensity Gradient Medium(Sigma-Aldrich公司)；anti-RFP(ORIGENE公司)；anti-tubulin(Engibody公司)；辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG(中杉金桥生物技术有限公司)；SDS-PAGE快速凝胶试剂盒(上海雅酶生物科技有限公司)；PEI MAX(Polysciences公司)。

1.2 方法

1.2.1 Dazl启动子的引物设计：根据GenBank上C57BL/6J小鼠Dazl序列(GeneID：13164)转录起始位点上游2 kb区域的序列特征分析结果,使用Snap Gene软件设计带有同源臂的上下游引物(表1)。

表1 PCR引物序列Table 1 Primers for PCR

1.2.2 小鼠基因组DNA提取：使用酚氯仿法[参考《分子克隆实验指南》(第2版)]提取成年ICR小鼠基因组DNA。测定A260 nm/280 nm值及DNA浓度，-20 ℃保存、备用。

1.2.3 小鼠生精细胞特异表达载体AAV-Dazl-RFP-Flag的构建： 以ICR小鼠基因组DNA为模板，通过PCR扩增出Dazl的启动子片段，用限制性核酸内切酶MluⅠ和BamHⅠ对腺相关病毒载体AAV-CMV-RFP-Flag进行双酶切，并对PCR和酶切产物进行纯化回收。通过同源重组的方法将酶切后的载体与PCR扩增片段连接，转化 DH5α感受态细胞，筛选出阳性克隆，进行测序。

1.2.4 细胞的转染：取增殖状态良好的GC1细胞和293T细胞分别传代至6孔板，每孔接种1×105个细胞,16 h后更换新鲜的DMEM完全培养基，2 h后使用Lipofectamine 3000 转染试剂将AAV-CMV-RFP-Flag和改造后的AAV-Dazl-RFP-Flag质粒分别转染GC1细胞和293T细胞中，转染48 h后分别通过免疫荧光，q-PCR、Western blot检测质粒表达效果。

1.2.5 免疫荧光检测RFP、Flag的表达：将转染过AAV-CMV-RFP-Flag和AAV-Dazl-RFP-Flag质粒的GC1细胞和293T细胞的细胞爬片取出，用1×PBS洗涤3次，0.3%的X-Triton透化10 min，1×PBS洗涤3次，5% BSA封闭30 min，一抗孵育4 ℃过夜，1×PBS洗涤3次，二抗室温孵育1 h，1×PBS洗涤3次，DAPI封片。用激光共聚焦显微镜拍摄细胞爬片。

1.2.6 q-PCR检测RFP mRNA体外表达水平：将AAV-CMV-RFP-Flag和AAV-Dazl-RFP-Flag质粒转染GC1细胞和293T细胞，培养48 h后，收取细胞，Trizol 法提取细胞中的总RNA，后用 RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit进行反转录，再通过q-PCR检测体外水平RFP的相对表达量。

1.2.7 Western blot检测RFP、Flag蛋白体外表达水平：将AAV-CMV-RFP-Flag和AAV-Dazl-RFP-Flag质粒转染GC1细胞和293T细胞，培养48 h后，收取细胞，SDS裂解样品，100 ℃煮10 min，12 000 r/min离心5 min，BCA法对样品进行定量并且制样后，用12.5%的SDS-PAGE凝胶进行电泳1 h，转膜1 h，封闭1 h，一抗4 ℃孵育过夜，TBST洗涤3次，10 min/次，二抗室温孵育1 h，TBST洗涤3次，10 min/次，进行显影，检测RFP蛋白的体外表达水平。

1.2.8 腺相关病毒(AAV)的包装：将AAV-CMV-RFP-Flag和AAV-Dazl-RFP-Flag质粒用PEI MAX试剂分别转染AAV-293细胞，转染24 h后换新鲜的DMEM完全培养基，转染72 h后收集上清和细胞。通过上清沉降和细胞裂解收集上清与细胞中的病毒，离心去除沉淀后，通过碘克沙醇密度梯度离心法进行病毒纯化，将纯化后的病毒浓缩至130～160 μL后进行滴度检测。

1.2.9 腺相关病毒(AAV)的注射：选取3周龄的ICR雄鼠，通过显微注射技术在左侧睾丸注射AAV-Dazl-RFP-Flag病毒，右侧睾丸注射AAV-CMV-RFP-Flag病毒，手术消毒缝合后饲养1周，取睾丸组织进行检测。

1.2.10 q-PCR检测RFP mRNA体内表达水平：取注射腺相关病毒后饲养1周的小鼠睾丸组织，Trizol 法提取睾丸组织中的总RNA，后用 RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit进行反转录，再通过q-PCR检测体内RFP的相对表达量。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 小鼠生精细胞特异表达载体AAV-Dazl-RFP-Flag的构建

通过PCR扩增得到1条大约1.7 kb的特异条带(图1A)，然后用限制性核酸内切酶MluⅠ和BamHⅠ对AAV-CMV-RFP-Flag载体进行双酶切得到一条大约5 kb的条带(图1B)，PCR产物与酶切产物同源重组构建的表达载体AAV-Dazl-RFP-Flag经过限制性核酸内切酶MluⅠ和BamHⅠ的双酶切验证正确(图1C)，并且测序结果与所构建的质粒图谱序列完全一致(图1D)。

2.2 免疫荧光检测RFP、Flag的表达

AAV-CMV-RFP-Flag与AAV-Dazl-RFP-Flag在GC1细胞中均有表达，并且两者的荧光强度相近(图2A)。而在293T细胞中，AAV-CMV-RFP-Flag与AAV-Dazl-RFP-Flag也均有表达(图2B)，但是转染了质粒AAV-Dazl-RFP-Flag的293T细胞荧光强度和细胞数量均弱于转染了该质粒的GC1细胞。

2.3 q-PCR检测RFP mRNA体外表达水平

通过检测RFP，观察到AAV-CMV-RFP-Flag与AAV-Dazl-RFP-Flag在GC1细胞与293T细胞中均有RFP表达，但是在GC1细胞中两种质粒的RFP的mRNA表达差异小于293T细胞(图3)。

2.4 Western blot检测RFP、Flag蛋白体外表达水平

通过检测RFP与Flag，观察到AAV-CMV-RFP-Flag与AAV-Dazl-RFP-Flag在GC1细胞中与293T细胞中均有RFP与Flag的表达， 但是在GC1细胞中两种质粒的RFP与Flag的蛋白表达差异小于293T细胞(图4)。

A.PCR product of Dazl promoter; B.digestion product of CMV-RFP-Flag vector; C.Dazl-RFP-Flag digested byMluⅠ andBamHⅠ; D. sequencing of connection site

图1 小鼠生精细胞特异表达载体AAV-Dazl-RFP-Flag的构建
Fig 1 Construction of mouse spermatogenic cell-specific expression vector AAV-Dazl-RFP-Flag

A.IF of GC1(×40); B.IF of 293T(×40)图2 免疫荧光检测RFP、Flag的表达Fig 2 Detection of RFP and Flag expression by immunofluorescence

*P<0.01 compared with control group图3 q-PCR检测体外RFP mRNA表达水平Fig 3 Detection of the expression of RFP mRNA in vitro by

图4 Western blot检测RFP、Flag蛋白表达水平Fig 4 Detection of the expression of RFP and Flag protein level by Western blot

2.5 q-PCR检测RFP mRNA体内表达水平

对3周的ICR雄鼠睾丸进行AAV注射，每个睾丸注射了15 μL包含0.04%锥虫蓝的AAV(图5A)。检测小鼠睾丸RFP的表达，q-PCR的结果表明注射了AAV-Dazl-RFP-Flag病毒的1#、2#睾丸中均检测到RFP的表达(图5B)。

3 讨论

自1960年发现腺相关病毒(AAV)以来，相关研究逐渐从体外发展到体内。基于AAV不整合基因组、具有高转导效率、并且具有低免疫原性和低细胞毒性等特点，使其成为目前用于基因治疗最具潜力的工具，并且已应用于临床治疗[5-6]。目前用于基因治疗的腺相关病毒(AAV)载体的特异启动子主要针对神经系统、肌肉、视网膜等部位[7-10]，对睾丸组织的研究较少。由于睾丸组织中包括生精细胞、支持细胞和间质细胞，CMV启动子载体包装成的腺相关病毒(AAV)注射进睾丸后在生精细胞和支持细胞中均有表达。所以本研究选择了在生精细胞中特异表达的Dazl基因的启动子，构建了含有生精细胞特异启动子Dazl的质粒，并且包装为腺相关病毒(AAV)，使其在睾丸的生精细胞中特异启动目的基因的表达，从而排除支持细胞的影响。

A.effect of testis injection; B.q-PCR of testis total RNA, *P<0.01 compared with control group图5 q-PCR检测体内RFP mRNA表达水平Fig 5 Detection of the expression of RFP mRNA in vivo by

为了研究Dazl启动子在生精细胞中的特异性，本研究首先利用构建的AAV-Dazl-RFP-Flag表达载体转染GC1细胞和293T细胞，在体外水平初步验证了生精细胞特异启动子Dazl在体外的启动效果。结果表明Dazl启动子在GC1细胞和293T细胞均能启动目的基因的表达。而据报道，Dazl基因除在生精细胞特异表达以外，在胚胎期细胞也可表达[11]。由于293T细胞属于胚胎期细胞，因此，在本实验中观察到AAV-Dazl-RFP-Flag在293T细胞中较低的表达水平。随后将该质粒包装为腺相关病毒(AAV)，通过显微注射技术注射到小鼠睾丸内，并在体内水平验证了Dazl启动子可以在生精细胞中启动目的基因的表达。下一步将继续优化AAV包装步骤，并通过流式细胞分选术、Western blot、免疫荧光等多个层面在体内水平检测AAV-Dazl-RFP-Flag在睾丸组织生精细胞内的特异表达情况。

以上结果表明小鼠生精细胞特异表达载体AAV-Dazl-RFP-Flag构建成功，并且验证了Dazl启动子在小鼠睾丸内正常启动目的基因的表达，从而增强了目的基因在生精细胞的表达特异性，为基因治疗在雄性生殖不育的治疗和研究上提供了更有效、更精准的载体工具。