傅小娇, 何世兴, 郑超, 余琳, 李汉邯, 杨占彪, 徐小逊, 程章

三种常见品牌护肤品暴露对鲮肝脏SOD和GST活性、GSH含量的影响

傅小娇, 何世兴, 郑超, 余琳, 李汉邯, 杨占彪, 徐小逊, 程章*

四川农业大学环境学院, 温江, 611100

研究护肤品暴露对鲮()的毒性效应, 为护肤品的安全使用和污染控制提供科学依据。配置不同浓度(0 g·L–1、0.5 g·L–1、0.75 g·L–1、1.00 g·L–1)的护肤品暴露鲮48h, 在暴露时间为0、6 h、12 h、24 h、36 h、48 h时, 测定鲮肝脏中超氧化物歧化酶(SOD)活性、谷胱甘肽转移酶(GST)活性、谷肮甘肽过氧化物酶(GSH)含量, 观察并记录鲮的死亡情况, 计算三种护肤品对鲮的半致死浓度(LC50)。结果表明: 三种护肤品的暴露浓度为1.00 g·L–1时, SOD酶和GST酶活性达到最大; 三种酶活性都是随着时间的增加呈现先增后减的变化规律; 护肤品B、C暴露48h时, GSH酶被抑制; 护肤品A、B、C 48h 的LC50分别为807 mg·L–1、973 mg·L–1和1147 mg·L–1。护肤品 A、护肤品 B 和护肤品C的毒性分别为中毒物质, 中毒物质和低毒物质, 中高价位的护肤品对鲮的伤害相对较小。

护肤品; 鲮; 暴露; 酶活性; 毒性效应

0 前言

药物及个人护肤品(Pharmaceutical and Personal Care Products, PPCPs)是与人类生活密切相关的一类有机合成物质的总称, 包含药品(兽类医药、人类服用医药)以及个人护理品两大类[1-2]。近年来, 个人护理品中的护肤品行业发展迅速, 各种效果的护肤品层出不穷, 已成为现代女性必不可少的物品之一。Reiner等发现一些个人护理品中含有加乐麝香[3]。麝香类物质对斑马鱼()的繁殖和早期生存有负面影响[4]。Wang[5]发现护肤品中会添加重金属、遮光剂等特殊物质, 这些成分一旦进入水体后, 不易被去除, 并易在环境生物中富集, 对动物及其他生物产生持久的污染效应。鱼类对有毒有害物质有较强的蓄积能力, 在这些有害物质的暴露下, 鱼体各组织器官中的超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽转移酶(GST)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH)等抗氧化酶的活性以及总抗氧化能力发生改变, 一定程度上能反映出机体在污染环境下的生理生化状态, 从而反映环境质量变化对生物的毒性效应, 所以鱼类可作为水体中一些污染物的早期生物监测指标[6]。

我国是护肤品的生产和使用大国, 据报告显示2020年的护肤品市场容量超过12000亿元[7]。目前, 我国也开始对环境中个人护理品的污染状况进行了研究[8-10], 但对其生态风险评价方面的研究较少, 尤其对不同价位的护肤品对鱼类影响的研究较少。鲮()隶属于鲤科、鲮属, 系一种亚热带杂食性底层鱼类, 具耐密养、病害少、生长快速、养殖周期短等优点, 且具有对多种农药、重金属[11]等毒物较敏感等特征, 主要分布在珠江水系、海南岛、台湾、澜沧江和元江一带, 是水环境监测和毒理性试验的理想试验动物。

本文利用鲮在三种不同价位的护肤品暴露下对SOD、GSH、GST酶活性的影响, 评价不同价位的护肤品不同浓度暴露对鲮的毒性效应, 为日常生活中护肤品的选择提供参考建议。

1 材料与方法

1.1 供试材料

(1)鲮, 购自珠江水产研究所, 体长4—5 cm, 体重1.8—2 g, 驯养于曝气48 h以上的自来水中, pH= 7.5, 温度为(23±2) ℃, 自然光照, 实验鱼种在护肤品暴露前先在实验条件下驯养1周。

(2)护肤品: 护肤品A(低价位, 约20—50元), 护肤品B(中价位, 约50~—200元), 护肤品C(高价位, 500元以上)。

1.2 试验设计

1.2.1 预备试验

2018年10月8日在四川农业大学生态毒理实验室放置体积为10 L的玻璃水缸, 其中加入曝气一周的自来水, 每缸放入30尾鲮, 试验期间水温控制在23—26 ℃, 溶氧6 mg·L–1以上, 连续充气, pH值为6.8—7.2。溶解三种护肤品, 控制5个间隔较大浓度梯度及空白组共4组, 设置3个实验重复。实验开始后第0、6、12、24、36、48 h时观察并记录各水缸中鲮的存活情况。

1.2.2 急性毒性试验

试验在10L的水缸中进行, 设置3个处理组(0.50 g·L–1、0.75 g·L–1、1.00 g·L–1)及其相对应的空白对照组, 每个处理设3个平行, 每缸40尾鱼。实验开始后于0 h, 6 h, 12 h, 24 h, 36 h, 48 h从各浓度水缸中取3尾活鱼样, 分别解剖取其肝脏混为1个样品, 立即放入- 80 ℃超低温冰箱冷冻待测。

1.3 测定方法

粗酶液的制备于试验当天将冷冻的肝脏取出, 在经-20 ℃预冷的研钵中加入少许石英砂和3.0 mL Tris 2蔗糖缓冲液,研碎后转入离心管, 10000 r·min–1离心15 min, 上清液即为粗酶液, 用于酶活性的测定, 每个样品测定4次。

SOD活性的测定: 采用邹国林[12]等改进后的邻苯三酚自氧化法对SOD 活性进行定, 活性单位为: 将一定条件下使每毫升反应液自氧化速率抑制50%的酶量为一个单位(U)。

GSH含量的测定: 酶标仪(购自上海菁华科技仪器有限公司)测定GSH含量(GSH检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所); 单位为: 每克酶样品37 ℃每分钟催化1 μmol GSH氧化的酶量。

GST活性的测定: 参照梁惜梅[13]的方法进行测定。GST活性单位定义:每毫克组织蛋白在37 ℃反应1 min扣除非酶促反应,使反应体系中GSH浓度降低1 μmol·L–1为1个酶活性单位(U·mg–1)。试验过程中用到的各种型号枪头、EP管、解剖剪、镊子等均需高温高压、干燥处理, 以减少污染。

1.4 数据处理

采用Origin 9.1软件进行作图及SPSS 24.0统计软件对所得数据进行统计学分析, 进行相关性分析及单因素方差分析(One way ANOVA)。

2 结果与讨论

2.1 三种护肤品暴露对鲮SOD酶活性的影响

图1为三种护肤品对鲮SOD酶活性的影响。浓度和时间是影响酶活性变化的重要因素。在时间-效应关系方面, 鲮SOD酶活性先增加后降低, 在时间为12 h时, 达到最大值, 约为对照组的5倍。在时间为6 h时, 酶活性最小, 约为对照组的2倍。在护肤品A与B暴露浓度为1.00 g·L–1下, SOD酶活性分别达到41.4 U·mg–1和37.56U·mg–1, 显著高于护肤品C的作用。12 h后随着时间的增加, SOD酶活性减少, 但也显著高于对照组, 酶活性没有受到抑制。

浓度-效应方面, 护肤品A暴露鲮6 h、12 h、24 h、36 h和48 h时间段, 鲮SOD酶活性随着浓度的升高而增加, 在浓度为1.00g·L–1时达到最大值(图1a); 护肤品B暴露鲮6 h、12 h、24 h和36h时间段, 鲮SOD酶活性随着浓度的升高而增加, 在48 h时, 酶活性无显著差异(<0.05)(图1b); 在护肤品C暴露下, SOD酶含量先随着浓度的增加而增加, 在暴露12 h后, 随着浓度的增加, SOD酶活性无显著差异(<0.05)(图1c)。

SOD酶普遍存在于水产动物体内, 是生物体内一种以自由基为底物的抗氧化酶, SOD酶能专一地清除体内有害的自由基[14], 以解除自由基氧化体内的某些组成成分而造成的机体损害, 常作为评价外源化合物产生氧化胁迫的重要生物标志物[15]。SOD酶的主要功能是将活性更强的超氧化离子(O2·-)歧化为活性更弱的H2O2, 随后H2O2被其他在细胞质或其他细胞器中的酶分解为水和氧气。研究中三种护肤品的暴露对鲮的SOD酶活性产生一定的诱导作用, 在暴露24 h后, 诱导作用逐渐减弱。有研究表明72% PPCPs能够使细胞膜上的过氧化脂质增加, 其基本氧化还原成份能通过影响肝细胞的氧化代谢作用进而导致氧化性损伤[16]。暴露初期, SOD酶活性增加来清除护肤品存在的有害基质, 随着时间的变化机体的酶合成受到抑制, SOD酶活性降低。本研究表明, 经过 48 h暴露, 在较低浓度下(0.50 g·L–1)即可造成对鲮抗氧化系统的氧化胁迫, SOD酶对护肤品污染均十分敏感。其中护肤品A暴露对鲮的酶活性影响最大, 其次是护肤品B, 影响最小的是护肤品C, 说明中高价位的护肤品可能所含有害自由基相对较少。

注: a是化妆品A, b是护肤品B, c是护肤品C; 不同大写字母表示时间-酶活性差异显著; 不同小写字母表示浓度-酶活性差异显著。

Figure 1 Effects of skin care products on the activity of SOD enzyme in

2.2 三种护肤品暴露对鲮GST酶活性的影响

三种护肤品暴露对鲮GST酶活性影响如图2所示。在时间-效应方面, 随着时间的累积, GST酶活性都处于诱导状态。整个实验过程中, 在三种护肤品暴露作用下, 暴露时间在6 h到12 h时间段, GST酶活性均显著高于其他实验组, 在暴露时间6h时候酶活性最大。护肤品不同浓度暴露, GST含量均显著高于对照组, 当浓度为1.00 g·L–1时, 酶活性被诱导最显著(<0.05)。随着浓度的增加, 使得机体产生更多的酶去消除护肤品暴露带来的有害物质, 所以在护肤品A暴露下(图2a), GST酶活性随着浓度的增加而增加。护肤品B暴露36 h过程中(图2b), GST酶活性随着浓度的增加而增加。护肤品C暴露24 h、36 h和48 h时(图2c), GST酶活性也随着浓度的增加而增加。

GST是生物体内解毒系统第二阶段的解毒酶。它可保护DNA及一些蛋白质免受损伤, 而且可与一些难溶于水的胆酸和激素等外源或内源的代谢产物反应, 生成一些水溶性的化合物, 然后排出体外[17], 达到消除生物体内存在的自由基和解毒的效果。同时, GST酶可催化谷胱甘肽(GSH)酶清除体内有害的亲电基团。图2(a, b, c)中GST活性都高于对照组, 说明在护肤品48 h的暴露下, 鲮GST活性都是处于被诱导的状态, 来抵御外源污染物的危害, 而后随着暴露的时间的延长, 护肤品中有毒有害物质在肝脏中富集量的增加, GST酶活性降低。柏世军[18]等的研究也获得了近似的结果, 3.00 mg·L–1Cr2+暴露罗非鱼(), 前20 d GST酶也是处于持续诱导, 随着胁迫作用时间的延长, 由于GSH的耗竭所致, 肝脏受到了严重的氧化损伤, GST酶失活。护肤品A、B暴露下, GST酶活性随着浓度的增加而增加, 可能是为了免受重金属的损伤而增加了GST的表达。所以不同价位的护肤品中存在的有毒有害物质对鲮的影响不同。护肤品A在暴露6 h后GST酶活性高于B、C护肤品28%左右, 说明中高价位的护肤品中存在的自由基以及有害的亲电基团相对较少。

注: a是化妆品A, b是护肤品B, c是护肤品C; 不同大写字母表示时间-酶活性差异显著; 不同小写字母表示浓度-酶活性差异显著。

Figure 2 Effects of skin care product C on the activity of GST enzyme in

2.3 三种护肤品暴露对鲮GSH酶含量的影响

三种护肤品暴露对鲮GSH含量的影响如图3所示。在时间-效应关系方面鲮GSH酶含量整体变化趋势一致, 随着时间增加呈现先增加后减少的趋势。护肤品A暴露时间为6 h, 浓度为1.00 g·L–1时, 酶含量最大为0.28 U·mg–1, 显著高于其他组酶含量(图3a)。护肤品B暴露12 h, 浓度为0.75 g·L–1时, 酶活性被诱导, GSH酶含量达到最大, 为0.32 U·mg–1, 为对照组的3.2倍, 而后随着时间的累积, 鲮机体平衡遭到破坏, GSH酶活性受到抑制, 酶含量显著减少, 在暴露时间为48h时, 酶含量最低, 与对照组相比抑制了60%(图3b)。护肤品C暴露12 h时, 暴露浓度为0.50 g·L–1时, 酶活性被诱导, GSH酶含量达到最大, 为0.23 U·mg–1(图3c)。在浓度-效应方面, 护肤品A暴露鲮24 h, 鲮的GSH酶含量与浓度呈现正相关(<0.05)。护肤品B暴露鲮6 h和24 h时, 鲮的GSH酶含量与浓度呈现正相关(<0.05)。在护肤品C暴露下, 鲮的GSH酶含量在36 h、48 h呈现显著负相关(<0.05), 在暴露36 h后, 随着浓度的增加, 护肤品C暴露使得鲮酶活性受到抑制。

注: a是化妆品A, b是护肤品B, c是护肤品C; 不同大写字母表示时间-酶活性差异显著; 不同小写字母表示浓度-酶活性差异显著。

Figure 3 Effects of skin care products on the activity of GSH enzyme in

GSH是机体最重要的非酶性(水溶性)抗氧化物, 可作为GST和GPx的底物, 通过这两种酶起解毒作用, 达到保护和恢复肾脏功能作用, 能清除机体内O2–、H2O2、LOOH 等脂质过氧化物[19,20]。因此 GSH 含量的多少是衡量机体抗氧化能力大小的重要因素。GSH含量增强是由于机体在对抗外界环境变化产生多余的活性氧[21]。在三种护肤品污染物作用下, 鲮GSH酶含量整体变化趋势一致, 均随着浓度的增加, 呈现先增加后减少的趋势。说明一定剂量的护肤品暴露能够增强鲮清除体内活性氧的能力, 随着浓度的增加, 护肤品中携带的重金属离子能够增加细胞内活性氧自由基的生成, 导致机体抗氧化系统紊乱。护肤品暴露会影响鲮GSH酶活性, 随着时间的变化, 甚至会抑制GSH酶的合成。三种护肤品暴露鲮12 h, GSH酶含量随着浓度先增加后减少, 耿晓修等[22]也有相似的发现, 用较低剂量的Cr6+染毒, 草鱼()肝脏GSH-Px的活力产生短暂的诱导效应, 后又随Cr6+剂量的增加而下降。三种护肤品作比较, 护肤品C在暴露12 h后GSH酶达到最值, 而护肤品B、C在暴露6 h时, GSH酶含量达到最值, 说明护肤品C产生的影响小于护肤品A、B的影响。

2.4 三种护肤品暴露对鲮的毒性

至48 h暴露试验结束, 对照组全部存活且未出现抑制现象。三种护肤品对鲮急性毒性试验的48 h的 LC50值见表2。在48 h暴露条件下, 三种护肤品引起50% 鲮死亡的浓度分别为807 mg·L–1、973 mg·L–1、1147 mg·L–1。根据化学品鱼类急性毒性分级试验标准[23], 显示护肤品 A、护肤品 B 和护肤品C的毒性分别为中毒物质, 中毒物质和低毒物质。

护肤品中很多成分进入水体中, 被水生生物富集于体内, 通过生物放大和生物累积作用在食物链间传递, 进而对更高营养级生物产生影响。不同价位的护肤品, 生产原料以及相应生产工艺流程也存在很大差异[1]。不同的油脂、乳化剂, 香料产生的效果, 对环境产生的影响也不一样。由于护肤品与人们的生活密切相关, 日常暴露的同时, 随洗漱废水排放到市政中, 而护肤品中如人工麝香、雌激素等物质很难被污水处理厂去除, 而被排放到环境中, 因此, 其对水生生态系统的富集性毒性效应值得深入研究[1, 4, 6]。

表2 三种护肤品对鲮的毒性实验

注:为死亡率概率单位, x为浓度的对数。

3 结论

不同护肤品暴露, 对鲮的SOD酶活性、GST酶活性、GSH酶含量产生不同程度的影响, 这些影响可以用作指示护肤品暴露的早期预警。暴露48h 鲮的LC50大小为C＞B＞A, 表明护肤品A的毒性大, 护肤品B次之, 护肤品C毒性最小, 说明中高价位的护肤品对鲮的影响较小。因此我们在选购护肤品的时候, 尽量选购中高价位的护肤品。

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Effects of exposure to three common brand skin care products on SOD, GST activity and GSH content of

FU Xiaojiao, HE Shixing, ZHENG Chao, YU Ling, LI Hanhan, YANG Zhanbiao, XU Xiaoxun, CHEN Zhang*

College of Environment, Sichuan Agricultural University, Wenjiang 611100, China

To study the toxic effects of skin care products on, and provide scientific basis for the safe use and pollution control of skin care products, the activities of SOD, GSH and GST in the liver ofexposed to skin care products with different concentrations (0 g·L–1, 0.5 g·L–1, 0.75 g·L–1, 1.00 g·L–1) for 48h were measured after exposure for 0, 6 h, 12 h, 24 h, 36 h and 48 h. The mortality ofwas recorded, and the semi-lethal concentration (LC50) of three skin care products onwas also calculated. The results showed that the activity of SOD and GST enzyme reached the maximum when the exposure concentration of three kinds of skin care products was 1.00 g·L–1; the activity of three enzymes increased firstly and then decreased with the increase of time; GSH enzyme was inhibited when skin care products B and C were exposed for 48 hours; the LC50of skin care products A, B and C for 48 hours were 807 mg·L–1, 973 mg·L–1and 1147 mg·L–1, respectively. The high and medium price skin care products showed relatively less toxic to

skin care products;; exposure; enzyme activity; toxic effects

10.14108/j.cnki.1008-8873.2020.03.018

Q954.3

A

1008-8873(2020)03-132-07

2019-07-05;

2019-09-09

四川省青年科技基金(17QNJJ0160)

傅小娇(1994—), 女, 硕士研究生, 主要从事生态毒理学研究, E-mail: fxjy516@126.com

程章, E-mail: cz@sicau.edu.cn

傅小娇, 何世兴, 郑超, 等. 三种常见品牌护肤品暴露对鲮肝脏SOD和GST活性、GSH含量的影响[J]. 生态科学, 2020, 39(3): 132–138.

FU Xiaojiao, HE Shixing, ZHENG Chao, et al. Effects of exposure to three common brand skin care products on SOD, GST activity and GSH content of[J]. Ecological Science, 2020, 39(3): 132–138.