董 浩，韩 焘，毕一鸣，原 霖，彭小薇，蒋 卉，冯 宇，吴同垒，秦玉明，王传彬

（1.中国动物疫病预防控制中心，北京 102618；2.中国兽医药品监察所，北京 102600；3.河北科技师范学院，河北秦皇岛 066000）

布鲁氏菌病（以下简称布病）是一种危害严重的人兽共患病，曾在全球160 多个国家或地区流行，被世界动物卫生组织（OIE）列为须通报动物疫病，是我国的二类动物疫病。近年来，随着我国牛羊养殖量的快速增加，以及牲畜调运的日益频繁，人间和畜间布病流行情况有加重趋势[1]。

畜间布病检测以血清学检测方法为主，但由于现有血清学检测方法与大肠杆菌O157、耶尔森菌O9 等菌株存在交叉反应，且无法区分免疫抗体与自然感染抗体，所以布病的血清学检测方法存在一定的局限性，而分子诊断技术以其快速、灵敏的特点备受青睐。OIE 在《陆生动物诊断与疫苗手册》中将普通PCR 和荧光定量PCR 技术均列为推荐的布病诊断方法。我国目前也有多种分子诊断类的检测方法被列入国家标准和行业标准。现行国家标准《动物布鲁氏菌病诊断技术》（GB/T18646—2018）中收录了Bruce-Ladder 多重PCR方法，其可以对布鲁氏菌进行分子分型。现行行业标准《奶牛布鲁氏菌病PCR 诊断技术》（NY/T 1467—2007）中采用的套式PCR 方法，进一步提升了PCR 方法的敏感性。《国境口岸布鲁氏菌荧光PCR 检测方法》（SN/T 4463—2016）适用于国境口岸的人或动物以及被布鲁氏菌污染物品的布鲁氏菌荧光定量PCR 检测。

目前，研究者们对布鲁氏菌的分子诊断实验方法开展了大量研究，如荧光定量PCR、等温扩增技术和数字PCR 技术等[2-4]，但对于分子诊断上游的核酸提取相关研究较少。本研究对市售的6 种不同类型的核酸提取试剂盒的布鲁氏菌提取效率进行了比较，以期为使用者正确选择提取方法提供参考。

1 材料与方法

1.1 样本来源

布鲁氏菌S2 疫苗株灭活菌液，由国家动物布鲁氏菌病参考实验室惠赠。

临床组织样品，采自辽宁省某羊场的2 只布鲁氏菌S2 疫苗株阴道免疫1 个月的山羊（免疫抗体滴度均为100 IU）。分别采集这2 只免疫山羊的心、肝、脾、肺、肾、肠系膜淋巴结、腹股沟淋巴结和颌下淋巴结样品各1 份（共16 份），由国家动物布鲁氏菌病参考实验室组织匀浆后，80 ℃灭活2 h。

1.2 试剂与仪器

1.2.1 提取试剂盒 磁珠法提取试剂盒：细菌基因组DNA 提取试剂盒，购自西安天隆科技有限公司（简称天隆细菌磁珠法）；磁珠法病毒DNA/RNA 提取试剂盒（简称天根病毒磁珠法）和磁珠法通用型基因组DNA 提取试剂盒（简称天根细菌磁珠法），购自天根生化科技（北京）有限公司。柱式法提取试剂盒：QIAamp DNA Mini Kit（简称Qiagen 柱式法），购自Qiagen 公司；血液/细胞/组织基因组DNA 提取试剂盒（简称天根柱式法），购自天根生化科技（北京）有限公司；FinePure Virus DNA Kit（简称济凡柱式法），购自济凡生物科技（北京）有限公司。

1.2.2 荧光PCR 检测试剂 GoTagProbe qPCR Master Mix，购自Promega 公司；荧光定量PCR所有引物探针，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2.3 主要实验仪器 Qiagen tissue lyser ii 组织研磨仪，购自QIAGEN 公司；GeneRotex 全自动旋转式核酸提取仪和Gentier 96E 全自动医用PCR分析系统，购自西安天隆科技有限公司；Thermo KingFisher DUO 磁珠提取仪，购自赛默飞公司。

1.3 比较方法

1.3.1 布鲁氏菌核酸提取 使用商品化PBS 缓冲液将布鲁氏菌S2 疫苗株灭活菌液进行102和104倍稀释。使用6 种核酸提取试剂盒，对200 μL 灭活菌液的稀释液和PBS 缓冲液（阴性对照），按照试剂盒使用说明书进行核酸提取，并将各试剂盒最终核酸洗脱步骤中洗脱液体积统一调整至100 μL。每个稀释梯度、每种试剂盒分别做4 个重复。对6种试剂盒的提取产物，经荧光定量PCR 检测后分别取平均值，计算每种试剂盒对这两个稀释梯度的布鲁氏菌灭活菌液样品提取效率的变异系数（变异系数=标准差（SD）/平均值×100%），从而评估各个试剂盒的批内重复性。使用6 种核酸试剂盒，对200 μL 各种组织样品的匀浆液进行核酸提取，提取过程按照试剂盒说明书进行，并将各试剂盒最终核酸洗脱步骤中洗脱液体积统一调整至100 μL。

1.3.2 荧光定量PCR 方法 使用荧光定量PCR方法，对提取的布鲁氏菌核酸进行检测。布鲁氏菌荧光定量PCR 方法，参考相关文献中发表的基于IS711序列的检测方法[5]。使用Gentier 96E 全自动医用PCR 分析系统进行荧光定量PCR 扩增。上游引物序列为5'-cgctcgcgcggtggat-3'，下游引物序列为5'-cttgaagcttgcggacagtcacc-3'，探针序列为5'-FAM-acgaccaagctgcatgctgttgtcgatg-BHQ1-3'。荧光定量PCR 反应体系为：GoTagProbe qPCR Master Mix 10 µL，10 µmol/L 的 上 游 引 物 和10 µmol/L 的下游引物各0.6 µL，10 µmol/L 的探针0.6 µL，DNA 模板2 µL，加入无核酸酶的水补齐20 µL。扩增程序为：95 ℃ 2 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40 个循环。在每个循环第2 步（60 ℃ 1 min）收集荧光信号。

2 结果与分析

2.1 布鲁氏菌灭活菌液提取效果比较

使用6 种核酸提取试剂盒，分别对102和104倍稀释的布鲁氏菌灭活菌液以及PBS 缓冲液进行提取，提取产物使用荧光定量PCR 分别进行检测。结果（图1）显示：6 种试剂盒均能对两个浓度稀释的灭活菌液进行有效核酸提取，对PBS 缓冲液阴性对照的提取结果均为阴性；除了天根细菌磁珠法对104倍稀释度的布鲁氏菌灭活菌液的Ct 值略高于QIAGEN 柱式法和天根柱式法，磁珠法提取产物荧光定量PCR Ct 值整体低于柱式法。结果说明，在进行灭活菌液的提取时，病毒DNA 提取试剂盒和细菌DNA 提取试剂盒均能有效提取核酸，但磁珠法提取效率整体高于柱式法。

图1 不同核酸提取试剂盒提取灭活菌液的效果比较

从试剂盒的批内重复性（表1）来看，6 种试剂盒对于102和104两个稀释度的布鲁氏菌灭活菌液的提取产物，经荧光定量PCR 检测的批内变异系数最高为3.88%，小于5%，同时阴性对照结果均为阴性，说明这6 种提取试剂盒均具有较好的批内重复性。

2.2 临床组织样品提取效果比较

分别使用6 种核酸提取试剂盒，对采集的16份免疫羊的临床组织样品进行核酸提取和荧光定量PCR 检测。结果（表2）显示：QIAGNE 柱式法和天根柱式法均能成功提取到16 份不同组织样品中的布鲁氏菌核酸；天根细菌磁珠法和天隆细菌磁珠法能提取14 份不同组织样品中的布鲁氏菌核酸，无法对2#羊的腹股沟淋巴结和肠系膜淋巴结样品实现核酸提取；济凡柱式法能够提取12 份不同组织样品的核酸，其中2 份提取样品的扩增Ct值＞39；天根病毒磁珠法的效果最差，仅提取到3份布鲁氏菌的核酸。

表1 不同核酸提取试剂盒的批内重复性比较

3 讨论

在建立核酸检测方法或开展相关的检测实验过程中，试验人员往往更关注于对检测方法的敏感性、特异性等问题的优化，而检测方法的上游试验核酸提取对于最终检测结果的影响往往容易被忽视。由于细菌具有细胞壁，使得细菌核酸提取试剂比病毒核酸提取试剂更为复杂，与病毒核酸提取试剂盒相比，细菌核酸提取试剂盒提取效率比对的相关研究相对较少。

为了评价不同类型的提取试剂盒对布鲁氏菌核酸的提取效率，本研究选取了2 种柱式细菌核酸提取试剂盒、2 种磁珠细菌核酸提取试剂盒、1 种柱式病毒核酸提取试剂盒、1 种磁珠病毒提取试剂盒，分别对灭活的布鲁氏菌菌液和免疫羊的不同组织样品进行了提取效率比较，同时比较了这6 种提取试剂盒的批内重复性。在提取灭活的布鲁氏菌液核酸时，6 种试剂盒均能够对两个稀释度的灭活菌液样品进行有效提取，且各个试剂盒的批内重复性均较好。在本试验中，布鲁氏菌菌液样品经过热灭活处理后，可能使绝大部分细菌的菌体结构被破坏。同时，该样品是用PBS 缓冲液稀释的，没有添加其他基质成分，使得各种核酸提取试剂盒中的裂解液和蛋白酶均可以在短时间内直接破坏细菌菌体成分，从而释放细菌核酸。在后续试验中，如果将灭活细菌加入到抗凝血、牛奶、冻精、不同组织匀浆液中，进一步对不同类型提取试剂盒的提取效率进行评价，将会得到更加科学的比较结果。

表2 不同核酸提取试剂盒提取临床组织样品的效果比较（Ct 值）

在对免疫动物的组织样品进行提取比较时，细菌核酸提取试剂盒（包括柱式和磁珠法）的提取效率远高于病毒核酸提取试剂盒（包括柱式和磁珠法）。其原因很有可能是病毒核酸提取试剂盒采取适用于含病毒的组织样品处理方法，无法充分对组织样品和组织样品中的布鲁氏菌菌体进行消化裂解，从而影响了后续核酸的提取。同时，从免疫羊不同组织脏器中的布鲁氏菌核酸的荧光定量PCR检测结果也可以看出，不同组织中的细菌含量也相对较低，所以才造成了2 种病毒提取试剂盒提取的核酸进行荧光检测后出现大量漏检。

临床组织样品提取效果较好的4 种细菌核酸提取试剂盒中，柱式细菌核酸提取试剂盒的成本明显低于磁珠细菌提取试剂盒，而且柱式细菌核酸提取试剂盒成功提取到了16 份组织样品中的布鲁氏菌核酸，但2 种磁珠细菌提取试剂盒均出现了2 份淋巴结样品的漏检。但是，在实际提取操作过程中，柱式细菌核酸提取试剂盒需要反复开盖、加液和离心，操作更复杂，造成交叉污染的概率更高。因此对于两者的选取，需要根据实验室条件、样品数量和任务紧迫性等多种因素综合考虑。

最后，在进行布鲁氏菌核酸检测过程中，除了选取正确的核酸提取试剂盒，还应该注意在前期组织处理过程中需要充分匀浆，在提取核酸时一定要完全消化组织匀浆液。同时，还应该在荧光定量检测过程中，配套使用内参引物探针，对提取效果进行质控，只有这样才能消除因在核酸提取步骤出现问题而导致的检测结果假阴性[6]。

4 结论

6 种核酸提取试剂盒均能有效提取布鲁氏菌灭活菌液，其中磁珠法提取效率略高于柱式法；柱式法细菌DNA 提取试剂盒的临床组织样品提取效率略高于磁珠法细菌DNA 提取试剂盒，但磁珠法和柱式法的病毒DNA 提取试剂盒均不适用于布鲁氏菌核酸提取。实际操作中，应根据实验室条件、样品数量和任务紧迫性等因素，选取应用合适的试剂盒。