向文杰，李德栋，林 俊，陈瑞红，杨木娇，薛 飞，朱远茂

（中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 兽医生物技术国家重点实验室，黑龙江 哈尔滨 150069）

牛传染性鼻气管炎病毒（Bovine infectious rhinotracheitis virus，IBRV）是引起牛呼吸道疾病的重要病毒性病原，感染后主要表现流涕、流泪、咳嗽、呼吸困难和体温升高等临床症状。IBRV 感染除引起呼吸道炎症外，还可引起结膜炎、乳房炎、脓疱性外阴阴道炎或龟头包皮炎、犊牛脑膜脑炎和流产等[1]。此外，IBRV 还可引起机体免疫抑制，进而继发细菌或支原体感染，导致牛呼吸道疾病综合征（Bovine respiratory disease complex，BRDC）[2]，给养牛业造成较大的经济损失。目前针对该疫病的防控措施主要有两种：一是在该病的低发区淘汰检测出的阳性动物；二是在该病的高发区接种相关的gE 基因缺失疫苗，并淘汰gE 抗体阳性动物。欧洲已经启动了IBR 的根除计划，奥地利、丹麦、芬兰、瑞典、瑞士等已根除了IBR[3-5]。我国牛群IBRV 血清阳性率约46%，时有IBRV 局部流行，目前对该病的血清学诊断主要依靠实验室的中和试验或ELISA，尚无自主研发的商品化IBRV 血清抗体检测试剂盒[6]，因此有必要开展相关诊断技术的研究。

本研究以经蔗糖密度梯度离心纯化的IBRV 全病毒作为免疫原，制备1 株IBRV 特异性单克隆抗体（MAb），再以该MAb 作为检测抗体建立检测牛血清抗体的阻断ELISA 方法。该方法具有较强的特异性和较高的敏感性，可以应用于IBRV 疫苗免疫监测和血清流行病学调查。IBRV 特异性MAb 的获得为IBRV 蛋白的结构和功能研究奠定一定的基础，阻断ELISA 方法的建立为我国IBR 的防控提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 病毒株、细胞及实验动物 IBRV Barthanu/67、牛病毒性腹泻病毒（BVDV）、牛副流感病毒3 型（BPIV3）由本实验室保存。牛肾细胞（MDBK）和SP2/0细胞由本实验室保存，6 周龄～8 周龄雌性BALB/c 小鼠购自辽宁长生生物技术有限公司。

1.2 主要试剂 聚乙二醇（PEG）、HT、HAT、弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗鼠IgG（IgG-HRP）、DMEM 均购自Sigma 公司；明胶购自FlakaAG 公司；脱脂乳购自博士德生物工程有限公司；马血清购自Hy-Clone 公司；3,3,5,5-四甲基联苯胺（TMB）购自北京泰天河生物技术有限公司；可拆卸ELISA 酶标板购自Costar 公司。

1.3 血 清 IBRV 标准阳性血清由本实验室制备并保存；IBRV 灭活疫苗免疫牛血清采自内蒙某一肉牛养殖场；IBRV 标准阴性血清采自黑龙江省某散养户牛；BVDV、BPIV3 和BADV-3 阳性血清由本实验室保存；O 型FMDV 阳性血清为疫苗免疫血清（周国辉副研究员惠赠）；血清样本采自内蒙古、黑龙江、江苏、吉林、山西、北京、广东等省（市、自治区）（辛九庆研究员惠赠）。

1.4 全病毒抗原的制备 将1000 TCID50IBRV 接种于已长成良好单层的MDBK 细胞，CPE 达80%以上收毒。病毒液经30%和60%的蔗糖密度梯度超速离心（100 000 g，4 ℃，3 h） 纯化，置-70 ℃保存备用。经SDS-PAGE 电泳观察纯化效果，并用分光光度计测定蛋白含量。

1.5 MAb 的制备 取纯化的IBRV，经灭活乳化后免疫6 周龄～8 周龄的BALB/c 雌性小鼠。取小鼠脾脏与骨髓瘤细胞SP2/0 进行常规的细胞融合，采用本实验室建立的间接ELISA 进行MAb 筛选，对获得的MAb 制备小鼠腹水。

1.6 MAb 的鉴定

1.6.1 间接免疫荧光（IFA）鉴定 待IBRV 接种于24孔细胞培养板中长成良好单层的MDBK 细胞，CPE达到80%左右时用-20 ℃预冷乙醇固定，然后加入MAb 腹水（1∶1 000），4 ℃作用过夜，加入山羊抗鼠IgG-FITC（1∶64），37 ℃避光孵育1 h，于倒置荧光显微镜下观察。同时设BVDV、BPIV3 和正常MDBK细胞对照。

1.6.2 Western blot 鉴定 纯化的IBRV 进行SDSPAGE 电泳，转移至硝酸纤维素膜上，用5%的脱脂乳4 ℃封闭过夜后加入MAb 腹水（1∶1 000），37 ℃作用1 h，加入Dylight 800 标记的山羊抗鼠IgG（1∶5 000），37 ℃避光孵育1 h 后于扫膜仪观察结果。1.6.3 质谱鉴定 根据1.6.2 试验结果，切取与MAb反应相对应的IBRV SDS-PAGE 电泳条带，由上海中科新生命生物科技有限公司进行质谱分析。

1.7 阻断ELISA 方法的建立及初步应用

1.7.1 最佳工作条件的确定 采用方阵滴定法确定全病毒IBRV 最佳包被浓度（1∶100、1∶200、1∶400、1∶600、1∶800、1∶1 000、1∶1 200 和1∶1 400，抗原蛋白浓度为5.35 mg/mL）和检测MAb cp-1-1 最佳稀释度（1∶100、1∶200、1∶400、1∶800、1∶1600、1∶3 200、 1∶6 400 和1∶12 800， MAb 浓 度 为

7.8 mg/mL），待检血清（1∶2、1∶4、1∶8、1∶16 和1∶32）和山羊抗鼠IgG-HRP（1∶5 000、1∶10 000 和1∶20 000）最佳稀释度最佳封闭液（1%明胶、2%明胶、3%明胶、5%脱脂乳、10%马血清和20%马血清），最佳封闭时间（1 h、2 h 和4 h），血清（0.5 h、1 h、1.5 h 和2 h）、MAb cp-1-1（0.5 h、1 h 和2 h）、羊抗鼠IgG-HRP（0.5 h、1 h 和1.5 h）和TMB（5 min、10 min 和15 min）的最佳作用时间。

1.7.2 临界值的确定 取实验室保存的50 份IBRV抗体呈弱阳性的牛血清（中和抗体效价为1∶4～1∶16），同时设标准阴性牛血清作为阴性对照，按照1.7.1 确定的阻断ELISA 操作程序进行检测，读取OD450nm值。规定以上述50 份弱阳性牛血清的平均OD450nm值加2 倍的标准差（SD）作为该方法的OD450nm临界值，按照如下公式计算抑制率临界值。

1.7.3 特异性试验 按照已建立的阻断ELISA 方法对IBRV、BVDV、BPIV3、BADV-3 和O 型FMDV 阳性牛血清进行检测，根据抑制率临界值判断该方法的特异性。

1.7.4 敏感性试验 选择中和抗体效价为1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128、1∶256、1∶512、1∶1 024 共10 份血清，对上述血清2 倍倍比稀释，每份血清最高稀释至比中和抗体效价高2 个滴度，例如中和效价为1∶4，则血清稀释至1∶16。用本研究建立的阻断ELISA 方法进行检测，确定该方法的敏感性。

1.7.5 重复性试验 取同一批次包被的ELISA 板，用IBRV 阴、阳性牛血清各3 份进行批内重复试验；取不同批次包被的ELISA 板，用IBRV 阴、阳性牛血清各3 份进行批间重复试验。计算批内和批间的变异系数。

1.7.6 符合率试验 取130 份现地牛血清，分别用中和试验和本研究建立的阻断ELISA 方法进行检测，计算该方法与中和试验的符合率。

1.7.7 阻断ELISA 方法的初步应用

1.7.7.1 用于免疫监测 内蒙古某肉牛养殖场实施了IBRV 灭活疫苗免疫，免疫后2 个月，采集206 份牛血清，采用本研究建立的阻断ELISA 方法进行检测，以评估疫苗免疫后抗体产生情况。

1.7.7.2 用于IBRV 血清抗体流行病学调查 收集我国10 个省（市、自治区）牛血清共801 份，采用本研究建立的阻断ELISA 方法进行检测，以调查我国IBRV 血清阳性率的情况。

2 结 果

2.1 全病毒抗原纯化结果 利用MDBK 细胞扩增的IBRV 经30%和60%蔗糖密度梯度超速离心后在60%层面上有一白色的病毒带，吸取脱糖后经SDSPAGE 电泳。结果显示，纯化的病毒与未纯化的病毒相比，培养液中的血清蛋白均去除，可见病毒的各结构蛋白，纯化效果良好（图略）。纯化后经分光光度计测定OD260nm/OD280nm为1.06，蛋白含量为5.35 mg/mL。

2.2 MAb 的筛选 经间接ELISA 筛选获得1 株阳性杂交瘤细胞，OD450nm值为1.95，命名为cp-1-1。经3次有限稀释法克隆纯化后阳性率为100%。

2.3 MAb 的鉴定 IFA 结果显示，MAb cp-1-1 与IBRV 呈阳性反应，可见特异性绿色荧光，而与BVDV、BPIV3 和正常MDBK 细胞均不反应（图1）。表明MAb 具有较强的特异性。

图1 MAb cp-1-1 的IFA 鉴定Fig.1 Identification of MAb cp-1-1 with IBRV,BVDV,BPIV3 and MDBK by IFA

Western blot 结 果 显 示，MAb 与 纯 化 的IBRV 在约100 ku 位置呈现阳性反应，可见特异性条带（图2）。表明，该MAb 可能为针对IBRV VP8 蛋白。

质谱鉴定结果显示，切取与MAb 呈western blot阳性反应相对应的IBRV SDS-PAGE 电泳条带，由上海中科新生命生物科技有限公司进行质谱分析，结果显示该蛋白为IBRV 的VP8 被膜蛋白（图略）。

2.4 阻断ELISA 方法的建立及初步应用

2.4.1 最佳反应条件的确定 根据方阵滴定及优化后的各反应条件，确定阻断ELISA 方法最优条件如下（表1）。

图2 MAb 与IBRV 反应的western blot 分析Fig.2 Western blot analysis of the reaction of the MAb cp-1-1 against IBRV

表1 阻断ELISA 检测方法的反应条件优化结果Table 1 The optimized of reaction conditions for blocking ELISA assay

2.4.2 临界值的确定 50 份IBRV 中和抗体呈弱阳性的牛血清按照确定的阻断ELISA 操作程序进行检测，结果显示其平均OD450nm为0.34（图3），标准差（SD）为0.045，根据平均OD450nm值加2 倍的标准差（SD）计算，OD450nm临界值为0.43。标准阴性牛血清的平均OD450nm值为0.897。按照临界值计算公式得出该方法的抑制率临界值为52.06%，即当抑制率≥52.06%时，判定结果为阳性，当抑制率＜52.06%时，判定结果为阴性。

图3 50 份弱阳性样品结果正态分布图Fig.3 50 weak positive samples normal distribution diagram

2.4.3 特异性试验结果 利用建立的阻断ELISA 方法对IBRV、BVDV、BPIV3、BADV3 和O-FMDV 阳性牛血清进行检测，结果显示仅IBRV 阳性牛血清抑制率达80%以上；其余均低于10%（图4），表明该方法具有较强的特异性。

2.4.4 敏感性试验结果 对中和抗体效价为1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128、1∶256、1∶512、1∶1 024 共10 份血清，分别标记为1～10 号。利用本研究建立的方法进行抗体效价测定，结果显示该方法可检测的最低中和抗体效价为1∶4，即中和抗体效价在1∶4 及以上时，该方法检测呈阳性。9号血清中和抗体效价为1∶512，采用该ELISA 方法检测的效价为1∶1 024，其它8 份血清中和抗体效价与该方法检测效价一致（表2），表明该方法与中和试验敏感性基本一致，中和抗体效价不低于1∶4 可检测为阳性。

2.4.5 重复性试验结果 重复性试验结果显示，6 份血清的批内重复试验及批间重复试验的变异系数均在10%以内（表3），表明该方法具有良好的可重复性。2.4.6 符合率试验结果 130 份现地牛血清，采用中和试验和本研究建立的方法进行检测，结果显示中和试验检测呈阳性的样品数为75，呈阴性的样品数为55；本研究建立的方法检测呈阳性的样品数为77，呈阴性的样品数为53。通过计算，该方法与中和试验的阳性符合率为100%，阴性符合率为96.36%，总体符合率为98.46%（表4）。

图4 特异性试验结果Fig.4 Specific test results

表2 阻断ELISA 方法与中和试验检测效价的比较Table 2 Comparison of the titer with the blocking ELISA method and neutralization test

表3 重复试验结果Table 3 Repeated test results

2.4.7 阻断ELISA 方法的应用

2.4.7.1 免疫监测 对内蒙古某肉牛养殖场实施了IBRV 灭活疫苗免疫的牛血清206 份进行检测，结果显示205 份呈阳性，阳性率高达99.51%（205/206），表明疫苗免疫后诱导抗体产生良好。

表4 符合率试验结果Table 4 Conformity test results

2.4.7.2 血清流行病学调查 对我国8 个省（市、自治区）共801 份牛血清，利用本研究建立的ELISA 方法进行检测，结果显示IBRV 抗体阳性率为0～86.89% ，总体阳性率为41.6%（333/801）（表5），表明我国IBRV 血清阳性率处于较高水平，应引起重视。

表5 血清流行病学调查Table 5 Serum epidemiological survey

3 讨 论

IBRV 是疱疹病毒科的成员，能够引起牛传染性鼻气管炎，感染牛容易继发细菌感染。该病毒可引起潜伏感染，导致乳汁减少、体重下降、流产甚至死亡[7]，给养牛业造成较大的经济损失[8]。流行病学调查显示我国IBRV 血清阳性率达46.03%（3933/8545），表明在我国存在严重的IBRV 感染。目前，国内尚无商品化IBRV 的诊断试剂，国外的检测试剂盒比较昂贵，因此有必要进行IBRV 相关检测技术的研究。

本研究曾尝试用环磷酰胺免疫抑制法筛选针对IBRV gE 蛋白的特异性MAb。先用IBRV gE 缺失株和环磷酰胺同时免疫小鼠，小鼠对IBRV 除gE 蛋白之外的其它蛋白产生免疫抑制，再用全病毒对小鼠加强免疫，以期筛选到针对IBRV gE 蛋白的特异性MAb。但可能由于环磷酰胺抑制强度或抑制时间不足，也可能由于VP8 蛋白是IBRV 含量最丰富的被膜蛋白，其未得到完全的免疫抑制，再者VP8 蛋白部分暴露在病毒粒子表面，造成本研究只筛选到针对IBRV VP8 蛋白的MAb，未获得针对gE 蛋白的MAb。

目前我国用于IBRV 抗体检测方法主要有中和试验、实验室自建的间接ELISA 和进口的竞争ELISA 方法，国内尚无商品化的抗体检测试剂。本研究利用IBRV VP8 MAb 建立了检测牛血清抗体的阻断ELISA方法。VP8 蛋白为IBRV 中含量最高的被膜抗原[9]，且为病毒的结构蛋白，在病毒的整个复制周期中一直存在，能够刺激机体产生较高滴度的抗体[10]，所以用针对该蛋白的MAb 建立的阻断ELISA 方法来检测抗体是可行的。IBRV nu/67 株的VP8 蛋白序列与国内其它IBRV 分离株序列一致性为100%，所以本研究建立的ELISA 方法能够用于国内IBRV 血清学检测。该方法可检测到IBRV 灭活疫苗免疫诱导的抗体最早时间为首次免疫后1 周，表明该阻断ELISA方法可以用于疫苗免疫后的血清抗体监测，根据监测结果可以快速确定疫苗免疫的效果和血清中的抗体水平，从而制定科学的免疫程序。此外，该方法可检测的最低中和抗体效价为1∶4，与中和试验的敏感性一致，中和试验检测需要5 d～7 d，该方法仅需1 d，大大缩短检测时间，为疫病的快速诊断和早期防控提供依据。

为了简化ELISA 操作术式，本研究尝试用HRP直接标记MAb cp-1-1 作为检测抗体，但标记后进行检测由于阴性样品OD450nm值偏低导致阻断率偏低，不易区分阴阳性，分析其原因可能有三点，第一，MAb经标记后部分降解或变性，有效MAb含量降低，导致与抗原结合量减少，使OD450nm值整体偏低，抑制率偏低；第二，MAb标记时可能存在未标记的MAb，检测时未标记的MAb竞争结合标记的MAb，导致OD450nm值整体偏低，抑制率偏低；第三，HRP与MAb标记结合量少，造成标记抗体效价偏低，同样导致OD450nm值整体偏低，抑制率偏低。为了解决这个问题，本研究委托生物技术服务公司进行MAb 标记，结果效价仍然偏低，可能与VP8蛋白本身结构有关。为此，本研究选择商品化的山羊抗鼠IgG-HRP 作为二抗，建立了阻断ELISA，虽然操作时多一步程序，但阻断效果良好，可用于IBRV血清抗体的检测。

本研究利用MAb cp-1-1 建立了阻断ELISA 诊断方法，该方法特异性强、敏感性高、重复性好，与中和实验的符合率为98.46%，可用于IBRV 免疫监测和血清流行病学调查，为我国IBR 的防控奠定了一定的基础。