李孟婕

摘 要：关于乳制品中黄曲霉素M1的检测技术来说，包括对高效液相色谱仪的测定条件就进行优化，测定相关系数等方式。本文对可以替代现有黄曲霉素M1免疫亲和柱的液液萃取方法进行了建立，对合适的萃取条件及萃取液进行了优选，进而确保操作方法更加简便。

关键词：乳制品;黄曲霉素;M1;检测

前言

作为一组与化学结构类似的化合物，已经在目前的情况下分离鉴定出AFM1、AFB1等多达12种，AFM1和AFB1是通过羟基化作用而在动物体内形成的一种代谢产物。在AFB1饲料被污染后，一旦奶牛摄入了这些饲料，就会在牛奶中有一部分AFB1转化为AFM1。而由于AFM1属于黄曲霉素的一种，对热、光、酸都比较稳定，常规的方法对其的效果都较差。因此，本试验优化AFM1的检测方法，以此确保检测工作的顺利进行。

1准备试验材料

试验材料的选择包括试验设备和试验试剂，试验设备包括电子天平（AUY220型）、12孔位、氮吹仪（BGC-12A型）、双频数显、高效液相色谱仪（LC1260）、高速台式离心机（GT10-1型）、FLD荧光检测器、WH漩涡微型混合仪。

试剂的选择包括优级纯乙腈、优级纯丙酮、优级纯甲醇、优级纯二氯甲烷、优级纯三氯甲烷、分析纯氯化钠;其中的试验用水应为去离子水。纯度99%的黄曲霉素M1标准品。

2运用试验方法

2.1处理样品

在检测纯牛奶的过程中，应进行样品前处理，纯牛奶的前处理，在50ML的离心管中取2g液态奶，并在其中加入0.5g氯化钠和18ML乙腈，在经过12min，35℃的超声后，经过10min，6000r/min的离心反应，然后，取5ML滤液在离心管中，并取上清液过0.5um唯恐滤膜，并在其中加入有机微孔滤膜。同时，在加入5ml二氯甲烷以后，利用1min进行漩涡震荡，再10min以6000/min离心，取1ML下层溶液将溶剂吹干，并将1ml甲醇加入以此对其复溶。就乳粉的前期处理来说，可以将1.5ML去离子水在0.5g乳粉中加入进行水复溶，纯牛奶的前处理步骤也可以参考本方案。

2.2测定与制备标准曲线

分配黄曲霉素M1标准储备液进行分别配制，使其成为浓度分别为1ng/ml，0.75ng/ml，0.5ng/ml，0.25ng/ml的标准系列溶液。在经过上机测定以后，可以将峰高设置为纵坐标，质量浓度设置为横坐标。其方程式为0.00032+0.01304x=Y，er0.9995则为其相关系数。

2.3萃取与净化试剂

乳制品中会含有较多的脂类和丰富的蛋白质，可以选择氮化钠、乙腈、丙酮作为试剂进行检测，同时，也可以将其用于对大分子物质的沉降方面，旨在确保荧光对其的干扰得以降低。由于丙酮具有较高的荧光本低值，会在一定程度上对检测的准确性和灵敏性产生影响，因此，需要通过使用乙腈对其进行进一步净化。在选择乙腈方面，可以对检测乳制品中的三聚氰胺的方法进行参考，而选择氯化钠则可以参考测定拟除虫菊酯农药分组的模式来进行。在选定净化试剂后，应选择萃取剂，三氯甲烷和二氯甲烷都是具有一定作用的物质，但是相比二氯甲烷来说，三滤甲烷的毒性较强，因此，选择二氯甲烷作为萃取剂是比较合适的一种方式。

2.4选择样品称样量

在进行检测的过程中，应对称样量进行设定，并在回收率的影响与称样量变化的关系进行研究。在进行实际方面，可以分别取乳粉1g，0.5g，0.1g;取纯牛奶5g，2g，1g进行标准化试验。同时，值得注意的是，应对称样量的数量进行确保，称样量数量过小，不仅会影响回收率的检测，同时也会对萃取、净化造成影响，同时也会影响到萃取后溶液的纯净度，因此，在进行加标回收试验的过程中，也应将19ML乙腈在称好的1g液体乳中加入，并与浓度为10ng/ML的1ML的混合液设置为标准品;将18ML乙腈在称取好的2g液体乳中加入，并与浓度为10ng/ML的混合液设置为标准品;将15ML已经加入称取好的5g液体乳中，并与浓度为10ng/ML的混合液设置为标准品，然后，在这种情况下对加标回收实验进行操作。

2.5选择超声时间

在进行黄曲霉素M1的检测过程中，对超声波提取技术进行运用，可以对毒素的扩散及溶解形成促进作用。在进行实验的环节，可以将温度调节在30℃，在这种条件下将单一变量设定为超声时间，并将超声时间分别设定为12min，10min，8min。通过试验后，得出一个结论，将超声时间设定为10min，是较为合适的试验时间。进而，从结果中可以得出一个结论，由于超声时间控制不当也会在很大程度上对回收率形成影响，这是由于时间过长反而会降低超声效率，而时间过短又不利于待测组的扩散与溶解。

2.6选择离心条件

在其他条件不变的情况下，可以将离心转速设置为单一变量，可以将离心转速分别设置为8000r/min，6000r/min，4000r/min，然后分析测定不同转速的回收率。在转速加大后，很有可能会对萃取效果产生影响，因此，本试验决定将离心转速选择为6000r/min，然后，在确定离心转速后，设置单一变量为离心时间，在离心转速过高的情况下，会发生沉浸，而在离心转速过低的情况下，也没有提供萃取效率，并且，通过试验表明，在离心回收率最高的10min的情况下进行试验其效果最为明显。

3检测结果

3.1曲线线性检验结果

在乳制品中黄曲霉素M1的检测过程中，检测员应分别在乳粉和纯牛奶中按照1ug/kg，0.75ug/kg，0.5ug/kg，0.25ug/kg的水平中将黄曲霉素M1的标准品进行添加，然后，对标准曲线方程进行绘制并测定。经过对标准化纯牛奶的曲线图谱及逆向测定，可以得出0.00038+0.01319X=Y，同时其相关系数为0.9979，而乳粉的标准曲线其回归方程式为0.00054+0.01565X=Y为其回归方程式，并且其相关系数为0.9951。通过上述测定可以得出一个结论，黄曲霉素M1的测定与本乳制测量方法相符合。

3.2检验精密度

在进行黄曲霉素M1的试验过程中，在空白样品中对标准溶液方法进行运用，而且，还应测定同一日期的相同浓度的样品，并且应保证测定的次数应达到10次以上。而就乳粉与纯牛奶的添加量也应保证相同剂量，可以在0.5ug/kg。通过检测结果可以得知，RSD在>1.9%，<2.85%的范围内，其检测的精密度较高，因此也有利于定量分析黄曲霉素M1。

3.3检出限检验结果

通过检测可知，回收率在>91.1%，<104.4%的范围内，波动范围较小且回收率的稳定性最强，因此也可以较为精准的分析检测物。此外，将黄曲霉素M1的信噪比按照3倍来測算，可以检出限为0.05ug/kg，这种情况较比我国目前规定的乳制品中黄曲霉素M1的限量标准要低。因此，可以明确的是，此方法的检测结果较为精准，并且，也可以确保检测结果的肯定值。

结语

综上所述，在本试验中对黄曲霉素M1的检测方法进行了优化，同时也应优化分析高效液相普条件以及其前后处理结果。本试验方式可以更加充分的将乳制品中的黄曲霉素M1的污染水平进行反映，并对回收试验进行运用，对净化液与萃取液进行优化，证明与检测要求相符合，同时，对牛乳制品中的黄曲霉素M1的检测较为合适。

参考文献：

[1]刘佳盟，赵慧芬，高星，张雪林，常硕，水明，苏燊.优化牛乳制品中黄曲霉毒素M1检测方法的研究[J].中国奶牛，2016（12）：45-48.

[2]李燕俊.乳与乳制品中黄曲霉毒素M1的检测方法（综述）[J].中国食品卫生杂志，1998（02）：3-5.

（辽宁辉山乳业集团（沈阳）有限公司实验室，辽宁 沈阳 110121）