黄 玲 邓 琳,2 初彩华 詹 卉 王曙光

(1.西南林业大学生命科学学院 昆明 650224； 2.毕节第三实验高级中学 毕节 553100； 3.西南林业大学亚太林学院 昆明 650224)

中国是竹子种类最丰富、分布最广的国家，有39属500余种(江泽慧，2011)。而竹类植物一般花周期较长，其营养生长阶段需经历60年甚至更长的时间才会进入生殖生长，大多数竹种开花后，往往会发生大面积的干枯与死亡，结实率低，在经济和生态上都会造成巨大的损失(Janzen，1976；林树燕等，2018a)。竹类植物这种开花生理特性，不仅给竹类有性生殖和胚胎发育研究工作带来困难，也极大地限制了竹类植物花器官的形态、分类与遗传学等方面的研究(林树燕等，2010)。

在植物有性繁殖过程中，花粉是种子植物的雄配子体，花粉与植物遗传育种密切相关，花粉的生活力是分析植物育性及繁殖能力的重要指标，其生活力是由遗传基础决定的，同时也受环境条件的影响而变化(王钦丽等，2002)。由于竹子零星开花、传粉的有效性低和花粉败育等，导致结实率低，使得竹子在开花结实和花粉萌发方面的研究进展缓慢。因此，花粉生活力在竹类植物遗传育种中尤为重要(林树燕等，2008a；2008b)。

现代分子生物学观点及已有研究表明，植物开花受自身基因的调控，其表达在一定程度上还受温度、光照和水分等环境因子的影响(田波等，2005)。前人的研究认为除上述因素可能导致的败育外，竹子开花还受营养元素的影响，由于糖分的不规则转化，导致竹子在开花过程中因营养供应不足而引起败育(徐振国等，2018)。因此，通过野外获取幼嫩时期的尚未分化的花芽进行试管培养，通过培养基为其提供充足的碳水化合物，同时避免外源植物激素的干扰，使其在试管内发育成小穗并开花，分析在避免野外不良环境条件的影响下的胚胎发育状况十分必要。

目前，对竹子开花现象已有较多相关报道，但对竹子花生殖器官和胚胎发育、花粉形态和萌发、小穗试管开花等方面研究相对较少，目前仅对10余种竹子花器官进行了详细描述，如毛竹(Phyllostachysedulis)、雷竹(P.violascens)、麻竹(Dendrocalamuslatiflorus)、巨龙竹(D.sinicus)、鹅毛竹(Shibataeachinensis)、异叶苦竹(Arundinariasimoniif.heterophylla)、月月竹(Chimonobambusaszechuanensis)、孝顺竹(Bambusamultiplex)、青丝黄竹(B.eutuldoidesvar.viridi-vittata)、绵竹(B.intermedia)、霞早绿竹(B.oldhamii‘XiaZao’ZSX)、黄条金刚竹(Pleioblastuskongosanensisf.aureostriatus)、翠竹(Sasapygmaea)等(孙立方等，2012；袁晓亮，2007；钟远标等，2017；王曙光等，2006；唐国建等，2016；王雨珺等，2017；林树燕，2009; 林树燕等，2009; 2017; 2018a; 2018b; 2019)。元江箭竹(Fargesiayuanjiangensis)属禾本科(Gramineae)箭竹属(Fargesia)，产于云南省元江、石屏，灌木状竹类(中国科学院中国植物志编辑委员会，1996)。目前已有彭晟等(2006)对元江箭竹花序的补充描述，以及何文志等(2017)对元江箭竹维管束及韧皮部纤维细胞发育过程的研究，但对元江箭竹花进行系统的胚胎学研究仍未有相关报道。通过对元江箭竹花序结构进行重新描述，并对其胚胎发育进行解剖学研究，测定花粉萌发力及对自然与组培条件下花器官、雌雄配子的结构解剖进行观察和分析，为竹类胚胎学、分类学和遗传育种积累原始资料，并为元江箭竹育种工作提供新的理论知识。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料于2018年7月15日上午采自西南林业大学珍稀竹种园内的元江箭竹。

1.2 花器官解剖观察

采集元江箭竹不同发育时期的小穗，浸泡于50%FAA固定液中固定，并真空抽气2 h待用。将采集到的小穗使用体式解剖镜(Olympus HO11)进行结构解剖、测量和拍照。将解剖出来的花药和子房，按李正理(1996)石蜡切片方法进行切片，利用番红固绿染色，置于光学显微镜(Nikon-ECLIPSE400)下观察并拍照。

1.3 组织培养

采取元江箭竹幼嫩尚未发育成熟的花芽作为外植体，连带花枝剪下，用湿报纸包裹捆绑，防止外植体因失水而死亡。将采集到的外植体用自来水冲洗1～2 h后，在超净工作台内用2‰的HgCl2溶液消毒14 min，消毒后用无菌水清洗5次，接种于30 g·L-1蔗糖、7 g·L-1琼脂、pH5.8的MS培养基中进行培养。

1.4 花粉活力、萌发率测定

采集元江箭竹盛花期即将成熟而花药未散粉的小穗，将收集到的小穗放置在干燥的硫酸纸上，阴干30～60 min，并人工收集花粉(王青等，2012)。

采用TTC染色法测定花粉活力。将收集到的花粉，置于凹面载玻片上，将配制好的TTC溶液滴加1～2滴，盖上盖玻片。染色5～10 min，每重复镜检3个视野，统计花粉总数和变红色花粉数，并根据实验公式(胡适宜，1993)进行计算：有生活力花粉百分数=变红色的花粉数/花粉总数×100%。

采用离体萌发培养法测定花粉萌发率。采用正交试验设计(蔗糖为50、100、150、200 g·L-1；硼酸为0.01、0.05、0.10、0.15 g·L-1)，将元江箭竹花粉洒在滴有营养液的凹面载玻片中央，置于25 ℃下培养，重复3次，显微测量花粉粒的直径、花粉管的长度，进行花粉萌发率计算(何风仙，2001；林树燕等，2008b)。

2 结果与分析

2.1 花序的结构

元江箭竹茎秆节芽、花枝顶端和侧芽节点可形成多个花序，在花序基部往往有1片叶鞘或带有叶鞘的营养叶包裹着上部的几枚小穗，几枚小穗共同组成花序，单个小穗又由多个小花组成(图1A、B)。当上部小穗发育成熟后，将营养叶剥开，花序基部有尚未发育成熟的小穗(图1C)。元江箭竹花序可由主轴、侧轴和小穗轴3部分组成，主轴上发生侧轴，侧轴上发生小穗轴，即花序属于单轴分枝(图1D)。竹子开花期间，整个花序中，中部和上部的小穗先开花，基部后开花。而在单个小穗中，基部小花先开放，上部小花后开放，顶端小花发育最晚甚至不育(图1C、D)。小花发育成熟后，内外稃张开，花丝伸出悬挂于小花外，花丝细长呈白色，花药为紫红色或淡黄绿色，可能由于温度差异所引起(图1E)。

2.2 小穗及小花的形态结构

元江箭竹花枝上每个小穗具颖片2枚，着生于基部，先端急尖。每个小穗有4～5朵小花，相邻小花间具明显小穗梗，长0.3～0.6 cm，节部膨大，具白色绒毛(图2A-C)。元江箭竹小花由稃片(内、外稃)、浆片、雌蕊和雄蕊4部分组成，为不完全花。小花均长0.9 cm，稃片2枚，外稃先端急尖，紫红色，边缘具硬毛。内稃对生于外稃内侧，具芒，背部具2脊，边缘具绒毛(图2D)。各时期内稃背部张开程度不同，小花成熟时期，内稃张开，内稃边缘呈淡紫色，花药伸出。小花未成熟时期，外稃长于内稃，成熟时期，内、外稃近等长(图2B、E)。浆片3枚，浆片位于雄蕊与内稃之间，1枚由内稃包被，另外2枚靠近外稃，较大。当雌、雄蕊发育未成熟时，浆片饱满透明，随着雌、雄蕊逐渐发育成熟，浆片变黄皱缩(图2G、H)。开花时，浆片吸水膨大，外稃被撑开，花药裸露垂悬于小花外，属于开放型(图2F; 图1E)。雄蕊3枚，花药黄色略带暗红色斑点，花药基部着生于花丝顶端，属于基着药，其尖端呈2分叉，花药成熟散粉时，花药尖端呈淡紫色(图2I)。雌蕊1枚，子房呈卵球形，柱头2裂，呈羽毛状，花柱短、柱头长，属于短花柱长柱头型，为雌雄异位(图2J)。雌蕊成熟后，子房表面具纹络，颜色呈黄褐色(图2K)。当小花发育成熟后，内外稃张开，柱头和花药同时伸出，雌雄蕊同熟(图2L)。

图1 元江箭竹花枝及花序

图2 元江箭竹小花的形态

2.3 子房及花药的解剖结构与发育

元江箭竹子房横切，可见其胎座类型为侧膜胎座(图3A)。将雌蕊纵切，可见元江箭竹具1室单子房，倒生胚珠，双珠被(图3F)。在胚珠发育时期，可见珠心与薄壁细胞相似，之后靠近珠孔端内的珠心开始分裂(图3B、C)。在胚囊母细胞时期，可见胚珠的双珠被开始分化，之后形成孢原细胞(图3D、E)。随后双珠被迅速伸长，胚囊母细胞经减数分裂最终形成4核胚囊(图3F)。由此可见，元江箭竹雌蕊发育前期正常。由于其野外开花较少，材料有限，再加上试验中出现的失误，元江箭竹成熟的雌配子体解剖结构未能观察到。

图3 元江箭竹子房及花药的形态及发育

通过对不同时期的花药进行解剖发现，在次生造孢时期，药隔组织将花药隔开形成4个药室，花药壁由外向内依次为表皮层、药室内壁(纤维层)、中层和绒毡层，同时造孢细胞分裂形成花粉母细胞(图3I)。花粉母细胞经过前期的物质准备开始进行减数分裂，经减数第1次分裂形成二分体，二分体进行第2次减数分裂最终形成四分体，完成减数分裂的整个过程(图3I-M)。四分体进一步发育形成4个独立的单核小孢子，随后单核小孢子体积逐渐变大，细胞质液泡化形成中央大液泡，将细胞核推向一侧，即为单核靠边期(图3N、O)。单核小孢子进一步发育，其液泡消失，细胞质占据整个细胞，细胞核进行1次有丝分裂，形成二细胞型花粉粒(图3P)。

小孢子母细胞时期，小孢子母细胞体积较大、近圆形，细胞质浓缩且没有明显的液泡产生(图3H)。小孢子母细胞形成二分体时期，二分体细胞呈对称型，同时其绒毡层开始出现退化，花粉成熟时，绒毡层细胞完全退化仅存薄层，元江箭竹的绒毡层细胞为腺质型(图3Q)。由此可见，绒毡层提供养分主要从二分体时期开始至花粉粒成熟(图3M、N)。当花药成熟后，药室内壁细胞木质化加厚形成间隔的纤维层，纵裂散粉(图3R)。

2.4 花药发育过程中的败育

对元江箭竹花药进行切片观察，在其发育的过程中，主要有以下几种败育现象：1)在小花发育的过程中，其绒毡层细胞发育异常，在次生造孢时期，绒毡层细胞向内出现过度肥大生长，占据整个药室，不能形成花粉母细胞(图4A)。2)部分花药壁出现皱缩，花药壁内物质融合成一团或花粉粒收缩，在单个药室内，部分中层和绒毡层退化，造孢细胞不能正常发育(图4B)。3)不形成有效小孢子母细胞。在小孢子母细胞分裂期，花药的维管束、药壁和药隔皆正常发育，小孢子母细胞退化或消失，部分小孢子母细胞发育异常(图4C)。4)不能形成有效花粉，出现空壳花粉粒。小孢子具萌发孔，但不具细胞核与细胞质(图4D)。

2.5 自然条件下花粉活力及萌发率分析

取元江箭竹成熟花粉在显微镜下观察，取30个视野，观察颜色和测量直径。根据对照组观察发现，元江箭竹花粉粒平均长47.48 μm、宽40.36 μm，形状近球形，具1个圆形萌发孔，花粉粒呈黄褐色。用TTC染色法测定其活力，观察发现部分花粉与TTC反应呈红色，元江箭竹花粉活力为54.78%(图5A、B)。

将元江箭竹成熟花粉分别置于配置好的16组营养液中进行培养，通过显微镜进行观察，发现元江箭竹几乎所有培养基培养的花粉粒均未形成花粉管，这说明元江箭竹尽管花粉粒活力达到54.78%，但绝大多数花粉粒不具备授粉能力，花粉萌发率极低，甚至不萌发(图5C)。由于绝大多数花粉粒没有长出花粉管，因此真正能进行正常授粉的花粉非常少。

图4 各种发育异常的花药

图5 花粉萌发和TTC染色

2.6 组培条件下花药结构与发育

取元江箭竹尚未分化花芽进行消毒后，接种于MS培养基中进行初代培养。当进行第1次继代后，小穗完成分化并伸出苞片外(图6A-C)。元江箭竹小穗进行第3次继代培养时，小穗开始在试管内开花，花药伸出小穗外(图6D)。通过对成熟的花药进行石蜡切片观察，发现组培条件下成熟花药的花药壁发育正常，不发生皱缩现象，由外向内依次为表皮、药室内壁和绒毡层，中层已经消失，绒毡层完全退化为一薄层，药室内壁形成较厚且连续的纤维层，花药纵裂，花粉粒被正常释放(图6E、F)。通过对其花粉粒进行显微观察，发现花粉粒发生败育，或融合成一团，或不具细胞核和细胞质，或出现皱缩等现象(图6G、H)。由此可知，元江箭竹花芽在组培条件下，虽然提供了充足的养分且能够发育为正常的小穗，但仍未产生正常可育的花粉粒，这与野外条件下败育现象一致。

图6 试管内开花及其花药结构

3 讨论

3.1 元江箭竹花序

竹类植物花序是以小穗作为基本单位，小穗本身是一枚穗状花序。根据李杨汉(1978)对花序的定义，将植物开花顺序由顶端和中部先开花随后向基部开花称为有限花序，将花序中由基部向顶部依次开花称为无限花序。而McClure等(1982)和耿伯介(1986)将竹类植物花序定义为有限花序(有限真花序)和无限花序(无限假花序)两大类型，即有限花序的花序连续一次发生，小穗基部不具潜伏芽，无限花序具有无限制的次序发生，在营养枝上具潜伏芽，与李杨汉(1978)对花序的定义是不一致的。而根据林树燕等(2018a)对霞早绿竹、黄条金刚竹、翠竹的研究发现，黄条金刚竹和翠竹基部不具潜伏芽但仍能分化出小穗，而霞早绿竹新形成的小穗是由前期分化的小穗基部产生，竹子中同一花序的小穗发育向基，同一小穗上的小花发育向顶，因此将竹类植物花序统称为混合花序。元江箭竹整个花序也为有限花序，中部和上部的小穗先开花，随后向基部侧生小穗陆续开花，其开花顺序具有限花序的特点。而单个小穗为总状花序，即无限花序，由小穗基部的小花先开放，随后再向顶部开放，其开花顺序具无限花序的特点。元江箭竹同时具备了2种类型的花序，因此其花序为混合花序，支持了林树燕等(2018a)认为竹类植物花序为混合花序的观点。

3.2 元江箭竹花器官特性

竹类植物的花一般由稃片、浆片、雄蕊和雌蕊4部分组成。根据花的构造和开花特点，可将竹子小花分为开放型和闭合型2种(林树燕等，2010)。元江箭竹为典型的开放型小花，开花时浆片吸水膨胀将内外稃片撑开，花药伸出，风媒传粉。

不同竹种雌雄蕊发育的同步化程度并不一致。林树燕等(2012)对鹅毛竹开花现象进行研究观察，发现鹅毛竹小花发育成熟时，花药先伸出散粉枯萎后，少量的雌蕊柱头才露出稃片。王曙光等(2006)观察到巨龙竹花药发育成熟伸出散粉时，雌蕊已萎缩干枯。这2种竹种均为雌雄异熟，但又不相同，鹅毛竹小花属于雄蕊发育成熟早于雌蕊类型，而巨龙竹小花则为雌蕊发育早于雄蕊类型。元江箭竹小花发育成熟时，内、外稃张开，柱头及花药同时伸出，此现象与月月竹(林树燕等，2009)小花发育雌、雄蕊同熟一致。

元江箭竹雌蕊花柱极短，而2叉分枝的羽毛状柱头极长，属于典型的短花柱长柱头型，与唐国建等(2016)报道的青丝黄竹柱头一致。元江箭竹花丝细长，花药成熟后花丝显著伸长，使花药垂悬于小花外，造成了雌、雄蕊空间位置的不一致，因此属于典型的异花授粉。此外，鹅毛竹(林树燕，2009)、月月竹(林树燕等，2009)、车筒竹(Bambusasinospinosa)(Wangetal.，2015)、巨龙竹(王曙光等，2006)、青丝黄竹(唐国建等，2016)等多个竹种的小花，均属于花丝细长引起雌、雄蕊异位并导致异花授粉这一类型。

3.3 元江箭竹的雄蕊败育

野外观察发现元江箭竹结实率极低，在整个开花期课题组没有收集到1粒种子，这主要是雄蕊败育造成的。在元江箭竹雄蕊发育过程中，可大量观察到花粉粒败育的现象，具体表现为4种类型：1)绒毡层细胞向内过度发育，未形成正常花粉粒；2)花药室发生皱缩、药室内物质融合成一团；3)花粉粒收缩变形、退化或消失；4)花粉粒细胞质、细胞核消失，花粉粒空壳。这些败育现象在大多数的竹种中都会出现，如Wang等(2015)对龙竹(Dendrocalamusgiganteus)、慈竹(Bambusaemeiensis)和车筒竹的败育进行研究，在龙竹中发现大部分花药室皱缩、花粉融合成团，而在慈竹和车筒竹中发现空壳花粉粒及绒毡层过度发育等现象。林树燕等(2012)发现鹅毛竹能正常发育的花粉数量很少，大部分小孢子发育异常甚至解体。除此之外，在月月竹(林树燕等，2009)、青丝黄竹(唐国建等，2016)、绵竹(王雨珺等，2017)、霞早绿竹(林树燕等，2019)中均有雄蕊败育的报道。

根据刘巧红等(2011)对不同发育时期甜菜(Betavulgaris)花粉TTC染色活力测定的研究发现，花粉中的脱氢酶可以将TTC还原成红色，若花粉中的酶失活则不能被染色，花粉生命力衰退或部分丧失生活力则染色较浅或局部被染色。李晓芬等(2009)对紫竹(Phyllostachysnigra)的花粉生活力进行测定发现，紫竹花粉生活力极高，但花粉萌发率却极低。而在麻竹和梁山慈竹(Dendrocalamusfarinosus)中也发现类似的现象，结实率低的原因与花粉的生活力无关(钟远标，2016)。元江箭竹花粉通过TTC染色显示其活力达54.78%，但花粉萌发率极低，说明元江箭竹花粉发育不良，甚至不育，只开花而不结实。因此，在分析竹子花粉粒败育时，仅仅依靠活力测定是不够的，必须要结合花粉萌发率进行综合分析。由于元江箭竹花粉粒皱缩、退化、消失或不具细胞质和细胞核等原因，加之开花竹丛少且为异花授粉，在自然条件下很难见到元江箭竹的果实。

3.4 组培条件下元江箭竹花芽发育及开花分析

Nadgauda等(1990)对印度箣竹(Bambusaarundinacea)组培条件下试管内开花研究发现，部分试管花外稃不能打开，花开不同步，致使结实率低，而且印度箣竹花药开裂时间及时长受湿度、温度及光照强度的影响。钟远标等(2017)认为，在麻竹开花后期由于植株体内消耗大量养分，会导致雌蕊的柱头发育不良，加上难以散粉等，都会导致麻竹结实率下降。同样是以麻竹为材料进行研究，发现麻竹在开花过程中，开花不育的原因之一是营养元素供应不足，由于竹子大量开花，加上营养元素的不规则转化，消耗大量营养，导致竹子只开花不结实(徐振国等，2018)。因此，通过组培条件下培养元江箭竹花芽，为小穗的发育提供充足的碳水化合物，避免外源激素及不良环境条件的影响，对于探讨元江箭竹花器官的发育状况是十分必要的。

本研究选取尚未分化的花芽为外植体，通过组织培养的方法为元江箭竹花芽发育提供充足的养分，使其在试管内自发的分化并发育为正常的小穗，且在试管内正常开花。不同于印度箣竹(Nadgaudaetal.，1990)的是元江箭竹内外稃可以正常打开，花药可以正常伸出小穗外，小穗及小花结构也发育正常，但其花药依旧未形成正常的花粉粒。这种败育现象暗示了元江箭竹花粉败育可能并不是由于大量开花导致竹丛养分不足而造成的，具体导致元江箭竹花粉败育的内在机理，尚需进一步研究。

4 结论

1)元江箭竹花序顶生或侧生，单轴分枝，混合花序。花序由多个小穗和小花组成，整个花序上部及中部小穗先发育成熟，渐及基部。单个小穗基部小花优先发育成熟，开花顺序由基部渐及中部和上部。2)元江箭竹开花为雌雄异位，开放型，异花授粉。花粉活力虽高，但花粉萌发率极低，甚至完全不萌发，导致元江箭竹结实率下降。3)元江箭竹属于典型的花药败育。花粉母细胞能进行正常的减数分裂，少数形成二核花粉粒，但多数花药无法形成具有受精能力的花粉粒，其花药败育可以总结为4种类型。4)花药发育异常是导致元江箭竹败育、结实率低的主要原因。通过组培手段提供充足的外源养分，未能提高元江箭竹花粉的可育性。