陈昕，李奇，陈懂懂，贺福全，霍莉莉，赵新全，赵亮*

1.中国科学院西北高原生物研究所，青海 西宁 810008；2.中国学科院三江源国家公园研究院，青海 西宁 810008；3.中国科学院大学，北京 100049

微生物是土壤生态系统中重要的组成部分，参与了植被凋落物的分解、土壤硝化和矿化、以及自身的呼吸作用等相关过程，其群落结构和多样性反映了土壤生态过程的变化（宿晓琳等，2018），建立了地上 (植物/凋落物)-地下（土壤食物网/土壤过程）的能量传输路径（David，2004），且通过这些过程驱动生物圈元素的循环（Zheng et al.，2018），并对环境的变化做出响应（林耀奔等，2019）。一些研究认为，地上植被群落结构差异改变了土壤的环境（Li et al.，2017a；Zhang et al.，2013），而土壤作为微生物的栖息场所，其理化性质的差异改变了微生物的多样性（Ge et al.，2008a；Drenovsky et al.，2010）及其微生物群落结构（宿晓琳等，2018；赵轻舟等，2018）。Trivedi et al.（2016）和 Louca et al.（2016）指出微生物群落结构的不同引起了菌群基因丰度的差异。可见，植被群落结构和土壤环境引起微生物群落变异，从而改变了土壤微生物功能基因丰度。因此，探究地上植被群落结构和地下土壤环境与土壤微生物功能基因之间的关系，有助于认识“植被-土壤-微生物”系统的能量流动、元素循环等调节机制。

土壤微生物参与了许多生物化学途径（Hug et al.，2018；Li et al.，2018；马大龙等，2016），而这些途径都是通过功能基因连接起来的（Zhang et al.，2014；张于光等，2007）。如，cbbL基因参与了固定CO2的卡尔文循环（Keshri et al.，2015），nifH基因参与了土壤微生物的固氮作用（Chen et al.，2019a），PPX基因参与了磷酸水解作用（Chen et al.，2019a；肖升木，2010）等。功能基因网络之间的相互作用能反映出微生物群落结构的原始组成（Singh et al.，2012）和复杂性（Wang et al.，2015；Raes et al.，2008），对功能基因的研究可将微生物循环过程具体化（Che et al.，2018）。且 Xu et al.（2018）研究还发现，基因丰度的增加可能是代谢过程加速的原因。本文以土壤微生物功能基因丰度为切入点来研究地上植被群落结构和地下土壤环境与土壤微生物功能基因之间的关系。

一些研究表明水分（Yan et al.，2018；范思思，2018；Zhao et al.，2019）、pH（刘充等，2015；Alessandra et al.，2019）、土壤速效氮（Cong et al.，2015）是影响土壤微生物群落结构的重要因素从而改变了功能基因丰度，还有文献指出地上植被群落结构也会影响功能基因丰度（Sun et al.，2019；Bradacova et al.，2019）。然而，在生态系统物质循环过程中微生物分解作用需要能量供给和运动载体（Tu et al.，2014；Zhang et al.，2020），地上植被的生物量是能量的主要来源，它通过凋落物与根际沉积返还到土壤，为土壤动物和微生物提供分解所需营养物质，而地下土壤水分是微生物分解运动过程的载体。因此，我们提出自下而上的土壤环境因子（Schoener，1989）和自上而下（Mueller et al.，2017；Schuman et al.，1999）的植被特性两个复合过程共同影响草地土壤微生物功能基因丰度。

青藏高原是地球“第三极”，海拔在4000 m以上，生态系统类型丰富（张玉波等，2017），在生态系统功能和生物多样性保护方面都具有重要的作用（刘哲等，2015；董世魁等，2017）。已有文献研究表明，青藏高原不同植被类型的生物量（王启基等，1991)、群落结构（杨元合等，2004；魏志成，2016；Gaston，2000）、土壤有机质（De Deyn et al.，2005）、土壤含水量与 pH 值（Alessandra et al.，2019）等存在明显差异，导致土壤微生物群落结构发生改变（卢慧等，2018a），进而使得功能基因丰度出现差异（卢慧等，2018b；李海云等，2018；Li et al.，2018）。然而，这些研究要么从地上的植被特性来解释差异性，要么从地下的土壤环境因子来解释差异性原因。本文以青藏高原三江源国家公园的高寒草原、高寒沼泽化草甸和高寒草甸为研究对象，通过调查3种草地类型的植被特性，测定土壤环境因子；运用基因芯片技术测定土壤微生物关键功能基因丰度；分析地上植被特性和地下土壤环境与土壤微生物功能基因丰度之间的关系，来验证土壤环境因子和植被特性共同影响青藏高原草地土壤微生物基因丰度的假说。

1 材料与方法

1.1 研究地点

本实验样品采自于三江源国家公园园区长期监测样地中。高寒草原长期监测样地，地处青海省果洛藏族自治州西北部玛多县扎陵湖乡（97°18′57″E，35°1′14″N，海拔 4309 m），该地年平均气温为-4.1 ℃，年均降水量为 303.9 mm，此高寒草原长期监测样地中植被类型主要以紫花针茅为建群种，其中常见种有早熟禾、藏嵩草、委陵菜属、火绒草、棘豆、麻黄等。高寒草甸长期监测样地（94°29′32″E，34°59′43″N，海拔 4400 m）与高寒沼泽化草甸长期监测样地（94°29′20″E ，34°59′36″N，海拔 4500 m）都地处青海省玉树藏族自治州曲麻莱县曲麻河乡，该地年均气温为-3.3 ℃，年均降水量在380—470 mm之间。其中高寒草甸长期监测样地植被类型主要以禾本科、莎草科为优势种，包括的常见种有龙胆科、豆科、毛茛科、玄参科等。高寒沼泽化草甸长期监测样地中植被类型主要以藏嵩草、小嵩草为优势种，常见种有禾本科、毛茛科、龙胆科等物种。

1.2 取样方法

在围栏内随机选取4个样方，对样方内植被进行物种调查，随后采集地上生物量；用土钻钻取样方内土壤两层，深度分别为0—10、10—20 cm，用于土壤含水量、土壤微生物量、土壤pH值、土壤速效氮指标的测定；用小钻进行土壤微生物取样，同一样方中取三钻0—10 cm土层样品，混匀，装入冻存管后放入液氮保存，用于微生物功能基因的测定。

1.3 分析方法

1.3.1 植被

群落结构：采用50 cm×50 cm的样方用样方法对植物物种多样性进行调查。

1.3.2 土壤

土壤含水量（烘干称重法）：称取鲜土于铝盒中，用鼓风干燥机进行烘12 h，然后进行称重。

土壤pH值（电位法）：利用0.005 mol·L-1的氯化钾溶液作为提取剂，通过pH计进行的测定。

1.3.3 微生物量

氯仿熏蒸浸提法：操作时，称取新鲜土样10.0 g 3份，放入100 mL烧杯中，一起放入干燥器，干燥器底部放入几张蒸馏水浸湿的滤纸、两个分别装有氢氧化钠溶液和无乙醇氯仿的小烧杯，并用凡士林封口，用真空泵抽取干燥器中空气，直至氯仿沸腾，将干燥器在25 ℃黑暗环境中放置24 h。同时用另外的干燥器进行相同操作，只是不加入氯仿，作为对照组。最后将培养好的土样与对照土样用0.50 mol·L-1的硫酸钾溶液浸提，测定其全氮、全碳后计算微生物量氮、量碳。

1.3.4 微生物功能基因

在已知的研究中（Cong et al.，2015）描述了在获得实验样品后，首先对样品中的微生物总 DNA进行提取，之后对DNA样品进行质检，纯化，使用 QIAquick纯化试剂盒将每个样品纯化后的土壤DNA进行荧光标记，最后与Ceochip 5.0杂交，杂交后通过扫描仪（Roche，Madison，WI，USA）进行扫描（Li et al.，2008），后将相对丰度芯片数据进行归一化处理并分析。其中，GeoChip 5.0是由安捷伦（安捷伦科技公司，SantaClara，CA）制造。

1.4 数据分析

1.4.1 基本指标分析

Shannon-Wiener指数（H）用于评估植被丰富度：

Pi为此物种个体数占总个体数比例。

Simpson指数（D）用于评估植被优势度的指数：

Pi为此物种个体数占总个体数比例；S为物种数目。

Pielou指数用于评估物种分布的均匀度：

H为Shannon-Weiner指数；S为物种数目。

1.4.2 数据统计分析方法

采用Excel 2007对原始数据进行归纳整理；利用 SPSS 17对不同草地类型下植物物种多样性指数、土壤环境因子进行单因素方差分析及回归分析，将上述处理完成的数据用Origin2016绘图。用R 3.5.2对功能基因丰度相关数据进行Hellinger转换，后用Canoco 5.0进行Redundancy analysis（RDA）绘图。

2 结果与分析

2.1 植物物种多样性指数及土壤环境因子分析

比较植物物种多样性指数发现，3种高寒草地类型多样性指数存在差异，其中高寒草原多样性指数较高；且3种高寒草地类型地上生物量也呈现显著差异，高寒沼泽化草甸地上生物量最高，高寒草甸、高寒草原次之（表1）。微生物所处土壤环境各不相同，存在明显差异性，沼泽化草甸的土壤含水量和土壤微生物量碳、土壤速效氮含量最大，土壤pH值最高的是高寒草原，而土壤微生物量氮则是高寒草甸较高（表2）。由此表明在3种不同高寒草地类型中，地上植被特性、地下土壤环境因子存在差异性。

表1 不同高寒草地类型下植物物种多样性分析Table 1 Analysis of Plant Diversity under different alpine grassland types

表2 不同高寒草地类型土壤及土壤微生物理化性质分析Table 2 Analysis of soil and soil microbial physicochemical properties of different alpine vegetation

2.2 土壤微生物功能基因丰度

从除趋势对应分析（Detrended Correspondence Analysis，DCA）图看出，不同高寒草地类型功能基因组成充分分离没有交错，高寒草原、高寒沼泽化草甸和高寒草甸的土壤微生物功能基因丰度存在明显差异（图1）。同时，比较碳循环、氮循环、磷循环和有机修复等9个微生物介导的关键生物过程基因丰度表明：3种草地类型的9种微生物介导的关键生物过程基因丰度存在显著差异（表3），碳循环的基因丰度最高，其次是有机修复、氮循环。

图1 不同高寒草地类型下微生物功能基因DCA排序图Fig.1 DCA analysis of soil microbial functional genes of different types of alpine vegetation

2.3 土壤微生物功能基因丰度与植被特性相关关系

将C循环、N循环、P循环、有机修复这四类土壤微生物功能基因丰度与植物物种多样性指数、地上生物量进行相关性分析，发现随着香浓维纳指数、辛普森指数、Pielou指数增加，四类循环的功能基因丰度呈先递减后增加趋势，且解释率在57.1%—61.2%之间，但在统计学上不显著（图2），说明地上植被群落结构对土壤微生物功能基因丰度的影响较小；而随着地上生物量增加这四类土壤微生物功能基因丰度增大，解释率达 77.5%—80.0%，且关系显著（P＜0.05）（图3），说明地上生物量作为土壤微生物供能源对微生物基因丰度的影响是明显存在的。总体来看，这四类功能基因丰富度随植物物种多样性变化产生的改变与随地上生物量变化产生的改变是相反的（图2、3）。

2.4 土壤微生物功能基因丰度与土壤环境的相关关系

将C循环、N循环、P循环、有机修复这四类土壤微生物功能基因丰度与土壤水分、pH值、土壤速效氮含量进行相关性分析发现，其中pH值对微生物功能基因丰度解释率最高值在 83.4%—87.5%间，关系极显著（P＜0.01），且微生物功能基因丰度随土壤pH值的增加而降低，表明土壤微生物功能基因丰度可随土壤酸碱性的改变而发生改变。土壤微生物功能基因丰度随土壤含水量、土壤速效氮含量的增加而增加，这两者对微生物功能基因丰度的解释率分别为81.9%—83.1%和71.3%—73.2%，其中土壤含水量与土壤微生物功能基因丰度呈显著相关关系（P＜0.05），但土壤速效氮含量与土壤微生物功能基因丰度并无显著相关关系（图4）。说明在土壤环境中，pH、土壤含水量作为非生物因子，影响着土壤微生物功能基因丰度。此外，由图5总体可看出土壤微生物功能基因丰度随土壤微生物量的增加而增加且呈显著相关关系（P＜0.05），其中土壤微生物量碳含量对土壤微生物功能基因丰度的解释率在76.8%—80.6%之间，土壤微生物量氮对功能基因丰度的解释率在80.6%—85.2%之间，得出土壤微生物量也是影响土壤微生物功能基因丰度的影响因素（图5）。表明，在土壤环境中，土壤含水量、土壤pH、土壤微生物量作为土壤理化因子影响了土壤微生物功能基因的丰度。

2.5 土壤微生物功能基因丰度与植被特性、土壤环境间的Redundancy analysis（RDA）分析

通过RDA进一步分析可看出，参与碳循环、氮循环的微生物功能基因丰度与地上生物量、土壤微生物量、土壤速效氮含量呈正相关关系，其中微生物量对这两类微生物功能基因丰度影响显著，地上生物量、土壤速效氮次之。而参与磷循环、有机修复的微生物功能基因丰度与植物物种多样性指数、土壤pH呈正相关关系，其中土壤pH是影响这两类微生物功能基因丰度的主要影响因素。总体来看，对这四类微生物功能基因丰度有影响的因素排序依次是土壤pH、微生物量、地上生物量、土壤速效氮、植物物种多样性指数，表明土壤微生物功能基因丰度受地上植被特性和地下土壤环境同时影响（图6）。

表3 不同高寒草地类型土壤微生物功能基因丰度Table 3 Abundance of functional genes of soil microorganisms in different alpine grassland types

图2 不同高寒草地类型微生物功能基因丰度与植物物种多样性相关关系Fig.2 Relationship between microbial functional gene abundance and plant species diversity in different alpine grassland types

图3 不同高寒草地类型微生物功能基因丰度与地上生物量相关关系Fig.3 The relationship between microbial functional genes and aboveground biomass in different alpine grassland types

图4 不同高寒草地类型土壤微生物功能基因丰度与pH、水分、速效氮相关关系Fig.4 Correlation between soil microbial functional gene abundance and pH,water,Rapidly available nitrogen in different alpine grassland types

图5 不同高寒草地类型土壤微生物功能基因丰度与微生物量碳、量氮间的相关关系Fig.5 Correlation between microbial functional gene abundance and microbial biomass carbon and biomass nitrogen in different alpine grassland types

图6 土壤微生物功能基因丰度与植被特性、土壤环境间的RDA分析图Fig.6 The RDA analysis of soil microbial function gene abundance and vegetation characteristics and soil environment

3 讨论

本文通过Geochip 5.0技术对青藏高原3种高寒草地类型进行土壤微生物功能基因丰度的测定，发现3种高寒草地类型土壤微生物功能基因丰度存在差异，其中高寒沼泽化草甸碳循环、氮循环、磷循环、有机修复等功能基因丰度最高，高寒草甸、高寒草原基因丰度次之（图1、表3），且这些差异由地下植被特性（如：地上生物量、多样性）和地下土壤环境因子（如：PH，水分，土壤微生物量）共同差异而产生的，支持了我们提出的假说。

3.1 地下土壤环境与土壤微生物功能基因丰度

土壤为土壤微生物提供了生存环境，其理化性质的不同会导致土壤微生物群落结构出现差异性（Galloway et al.，2008）。Carney et al.（2005）提出，土壤微生物循环过程中微生物可通过自身，为参与地球化学循环过程供能，微生物量越多，基因丰度越高，可促进微生物分解能力（Xue et al.，2016）。本文通过分析青藏高原三江源地区草地的土壤微生物量与基因丰度关系也证实了这一点，土壤微生物量越多，其基因丰度越高（图5），并且由于土壤微生量存在差异（表2），相应的微生物功能基因丰度也显著差异（表3）。因此，土壤环境中微生物量作为一部分能源供给，其改变使微生物功能基因丰度也发生改变。同时，Ge et al.（2008b）和侯海军等（2014）认为pH和水分是影响微生物数量及功能基因丰度的重要土壤理化因子。水分作为微生物循环过程的主要载体，驱动着元素的循环（Ren et al.，2017；孙欣，2015），而pH的不同改变了水分的酸碱性，造成了基因丰度的差异（Cao et al.，2016），本文研究表明土壤pH作为土壤环境因子与微生物功能基因丰度存在显著相关关系（P＜0.01），且土壤微生物功能基因丰度随土壤pH上升呈下降趋势（图4）。水分作为循环过程的载体与微生物功能基因丰度也存在相关性，随着土壤含水量的增加微生物功能基因丰度也呈增长趋势（图4）。由此得出，土壤pH、土壤微生物量、土壤含水量作为地下土壤环境因子影响了微生物功能基因丰度使其出现差异性（图4、表3），表明土壤环境中pH、土壤微生物量、土壤含水量等理化因子是影响微生物功能基因丰度的关键因素之一。

3.2 地上植被特性与土壤微生物功能基因丰度

植物和微生物作为陆地生态系统重要的纽带，它们之间的相互作用在生态系统中是不可缺少的（蒋婧等，2010）。Chen et al.（2019b）认为植物物种多样性与土壤微生物功能基因丰度之间存在密切相关关系，并强调植物物种多样性在维持地下生态系统功能中起着不可替代的作用。已有研究表明，不同植被类型改变了微生物的群落结构（Zhang et al.，2013），从而影响了菌群的丰富度和均匀度（王超等，2019），使功能基因的丰度出现差异性（Rocca et al.，2015；Wood et al.，2015）。但本文研究发现地上植物物种多样性与功能基因丰度虽存在相关性，且土壤微生物功能基因丰度随着植物物种多样性的增加呈下降趋势，但生物学统计不显著（图2）。说明在本研究中地上植物物种多样性对土壤微生物功能基因丰度的影响不明显，这与 Guo et al.（2018）研究结果一致，且此研究进一步指出（Guo et al.，2018），随着年限的增长土壤微生物功能基因丰度才会因植被群落结构有差异而发生改变，有待后续证实。此外，微生物在分解过程中需要凋落物提供营养完成循环过程，地上生物量越丰富给地下微生物提供的能量就越多，微生物数量也会增加（Deng et al.，2019；Li et al.，2017b）。本文将地上生物量与微生物功能基因丰度进行回归分析发现，地上生物量与功能基因丰度存在显著相关关系（P＜0.05），微生物功能基因丰度随地上生物量的增加呈上升趋势（图3），且通过比较3种高寒草地类型地上生物量发现，高寒沼泽化草甸地上生物量最高，高寒草原、高寒草甸次之，使草地类型对应的土壤微生物功能基因丰度也是高寒沼泽化草甸最高，高寒草甸、高寒草原次之（表1、表3），表明地上生物量作为能量来源，是控制微生物功能基因丰度存在差异的影响因子。

3.3 土壤微生物功能基因丰度控制因子

本文通过用RDA分析发现土壤pH、微生物量、地上生物量是影响微生物功能基因丰度的主要因素（图 6）。有研究指出，地上植被群落结构差异（Wang et al.，2017）改变了pH、水分等环境（Li et al.，2017a；Bardgett et al.，1999）。本研究中 3个长期监测样地植被群落组成、年均降雨量、年均温存在明显不同，使土壤贮存的含水量出现差异（表2），进一步改变了土壤酸碱度（表2）。而土壤pH作为环境因子其改变间接地改变了地下生态过程（De Deyn et al.，2005；Gladys et al.，2006）。因此，本文将土壤pH与微生物功能基因丰度作回归分析，发现土壤微生物功能基因丰度与这两种环境因子存在显著相关关系（P＜0.05），其中土壤微生物功能基因丰度随pH的增加而减少，说明土壤环境因子的改变会改变微生物功能基因丰度（图4）。Bardgett et al.（1999）指出不同草地类型下植被覆盖度不同使土壤温度、湿度出现差异，进一步影响了土壤微生物量的含量（文都日乐等，2010；Bardgett et al.，1999），从而改变了微生物功能基因丰度。其中土壤微生物量作为土壤有机质的一部分，为土壤参与循环过程提供了能量，而土壤有机质主要由地上植被凋落物沉积所提供的（Xue et al.，2016）。通过研究发现青藏高原3种不同的高寒草地类型中，地上生物量存在明显差异（表1），地上生物量的不同改变了土壤有机质含量进一步影响了土壤微生物量（表2），将地上生物量、土壤微生物量分别与微生物功能基因丰度进行相关性分析，发现微生物功能基因丰度随两者的增加而增加（图 3、5），表明地上生物量、土壤微生物量作为供能源，其不同会改变微生物功能基因丰度。综上所述，地上植被特性因子地上生物量作为自上而下控制因子，土壤环境因子pH和土壤微生物量作为自下而上的控制因子共同作用于土壤微生物功能基因丰度，导致不同植被类型之间的土壤微生物功能基因丰度存在差异。

4 结论

本文基于 Geochip 5.0技术分析了三江源国家公园地区高寒草原、高寒沼泽化草甸、高寒草甸 3种不同草地类型土壤微生物功能基因丰度的差异性。通过探索青藏高原高寒草地类型地上植被特性、地下土壤环境与土壤微生物功能基因之间关系，发现地下土壤环境因子pH、水分、微生物量对功能基因丰度有显著影响（P＜0.05）；地上植被特性中地上生物量与功能基因丰度存在显著相关关系（P＜0.05）。在生态系统物质循环过程中微生物分解作用需要能量供给和运动载体，地上植被的生物量是能量的主要来源，它通过凋落物与根际沉积返还到土壤，为微生物提供分解所需营养物质，而pH大小调节土壤酸碱度影响微生物活动能力，地下土壤水分是微生物分解运动过程的载体。因此，我们认为地下植被特性（如：地上生物量、多样性）和地下土壤环境因子（如：pH，水分，土壤微生物量）共同差异引起土壤微生物功能基因丰度不同，自上而下的地上植被特性和自下而上的地下土壤环境两个复合因子影响青藏高原草地土壤微生物功能基因丰度。通过本文研究进一步提出有关猜想，植被特性中不同草地类型地上生物量可为微生物循环过程提供能量造成微生物功能基因丰度出现差异性，但造成这一差异性出现的原因是否与植被质量，如纤维素、半纤维素、木质素含量的不同有关。此猜想会通过进一步研究在后续文章证实。