马志辉，冀弘艺，李荣华，侯文韬，方长旬，章家恩*，王瑞龙*

1.华南农业大学资源环境学院生态学系，广东 广州 510642；2.农业农村部华南热带农业环境重点实验室，广东 广州 510642；3.广东省生态循环农业重点实验室，广东 广州 510642；4.广东省现代生态农业与循环农业工程技术研究中心，广东 广州 510642；5.福建省农业生态过程与安全监控重点实验室/福建农林大学生命科学学院，福建 福州 350002

薇甘菊（Mikania micranthaKunth）是菊科（Asteraceae）假泽兰属（Mikania）多年生藤本植物，原产于热带中南美洲，现广泛入侵热带亚洲和太平洋岛屿，对入侵地的生态系统和农林业生产，造成严重生态灾害和经济损失（王伯荪等，2003）。目前我国广东、云南、香港、澳门、台湾受害严重，海南和广西正处于危害初期（李鸣光等，2012）。薇甘菊生长速度快，繁殖能力强；同时薇甘菊的茎叶挥发物和凋落物对邻近植物的化感抑制作用促进其快速蔓延和扩散（王伯荪等，2003；李鸣光等，2012）。薇甘菊在我国仍有不断扩散趋势，防除薇甘菊已经迫在眉睫（李鸣光等，2012；Day et al.，2016；Sun et al.，2019）。

目前关于入侵植物在入侵地扩张过程中的生理生化适应机制是入侵生态学领域研究的热点（Phillips et al.，2010；Lankau et al.，2011；Xiao et al.，2019）。研究表明大区域尺度下环境的异质性可促进外来入侵植物适应入侵地的环境条件，从而促进外来植物入侵后期的快速适应性进化（Bezemer et al.，2014）。为适应不断变化的环境，植物演化出不同的生存策略，如通过改变基因型的适应性策略（Agrawal et al.，2015）、通过表型可塑性的生态策略（Liu et al.，2016）、通过改变防御与生长/繁殖资源分配的资源分配策略（Xiao et al.，2019），这些策略有利于入侵植物适应原产地和入侵地间不同地理环境内生物和非生物因素的变化。如通过对入侵植物美洲商陆（Phytolacca americana）沿纬度梯度（25.72°—36.15°N）开展野外调查与采样分析，结果发现美洲商陆的生长、繁殖和防御性状在入侵地表现出纬度梯度格局，美洲商陆在高纬度地区具有更多的分枝和更高的果实皂苷含量，这可能是美洲商陆对环境变化的一种可塑性响应（Xiao et al.，2019）。

关于非生物环境对薇甘菊入侵的影响目前主要集中单一环境因素，如光照（王文杰等，2008；李晓霞等，2018）、温度（王瑞龙等，2012；范志伟等，2016）、水分（徐高峰等，2013；Wang et al.，2016）、盐度（胡亮等，2014）和酸雨（宋莉英等，2013）等对薇甘菊的影响。目前综合研究入侵地的各种环境因素对薇甘菊的影响，尤其是在华南地区不同地理种群薇甘菊叶片挥发性有机化合物的变化尚未见报道。本研究利用GC-MS对华南地区薇甘菊23个不同地理种群230个薇甘菊个体叶片挥发性有机化合物的组分进行测定，通过线性混合模型分析不同地理种群薇甘菊叶片挥发性有机化合物和自然环境因素的相关性，同时通过聚类分析和主成分分析研究不同地理种群薇甘菊叶片挥发性有机化合物组分的特征，进而探讨薇甘菊在华南地区入侵地不同地理种群叶片挥发性有机化合物的变化规律，旨在为丰富和完善外来植物入侵机制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 样品采集

薇甘菊在华南地区 23个不同地理种群的样品采自2018年4月（表1），选生长于背风向阳处的薇甘菊群落，每个地理种群分别采集 10个当年生长度约1 m薇甘菊幼嫩枝条作为样本，同一种群不同样本植株间距离保持15 m以上，以确保每个样本来自不同的个体。不同地理种群的薇甘菊幼嫩枝条上的叶片在自然条件下风干后分别置于密封袋中待用。

1.2 样品预处理与分析检测

1.2.1 薇甘菊叶浸提液的制备

分别在每个地理种群的薇甘菊样品中选取健康叶片 10片，在研钵中加入适量液氮分别将其研磨成粉状，称取0.2 g，置于4 mL的棕色样品瓶中，加入4 mL正己烷（色谱纯），4 ℃条件下浸提10 d，然后用0.22 µm的滤膜过滤并转移浸提液到1.5 mL棕色样品瓶中，放入4 ℃冰箱中保存备用。

1.2.2 GC-MS 检测

所用仪器为Thermo-Finnigan Trace-DSQ气相色谱-质谱联用仪，参考JJF 1164—2006《台式气相色谱-质谱联用仪校准规范》进行校准。色谱条件：色谱柱为 DB-5MS石英毛细管色谱柱（30 m×0.25 mm×0.25 µm）。升温程序：初温为50 ℃，以 5 ℃·min-1升至 120 ℃，再以 2 ℃·min-1升至150 ℃，保留 2 min；分流比为 5∶1，进样量为 1µL，进样口温度设置为250 ℃，载气为氦气，流量 1 mL·min-1。接口温度 280 ℃，离子源温度230 ℃，EI电离源69.9 eV，扫描范围35—500 amu。获得气相色谱-质谱总离子流图，根据NIST谱图库检索，同时结合相关文献（Bravo-Monzón et al.，2014）进行定性分析；采用色谱峰面积归一法计算得出各化学成分的相对百分含量。

表1 华南地区23个薇甘菊种群的采集地环境信息Table 1 Environmental characteristics of 23 sampled populations of Mikania micrantha distributed in South China

1.3 采样点地理环境信息

利用GPS定位仪精确定位采样点的地理位置，测定经度、纬度和海拔高度。通过中国气象数据网（http://data.cma.cn）收集采样点所在地的年均降水量数值（表1）。

1.4 数据统计

薇甘菊叶片中挥发性有机化合物的含量采用色谱峰面积归一法计算得出各化学成分的相对百分含量；以种群所在的地理位置信息，即经度、纬度、海拔高度、平均温度和年均降水量作为自变量，挥发性有机化合物的峰面积作为协变量，采集种群作为随机因子，采用线性混合模型分析气候环境因素对薇甘菊叶片中5种主要挥发性有机化合物含量的影响；对不同地理种群的含量较多的5种挥发性有机化合物进行了主分成分析和聚类分析。所有数据用SPSS 20.0统计软件进行数据分析处理。

2 结果与分析

2.1 不同地理种群薇甘菊叶片浸提液的化学成分分析

薇甘菊叶片浸提液经GC-MS分析，通过质谱库检索和人工图谱解析，结合保留指数比对，从23个不同地理种群的薇甘菊叶片中共鉴定出 42种挥发性有机化合物，利用面积归一化计算得出各成分相对百分含量（表 2）。其中薇甘菊叶片挥发性有机化合物以倍半萜类化合物为主，其中β-荜澄茄油烯（24.63%）、β-石竹烯（16.81%）、大香叶烯 D（10.47%）、α-古芸烯（9.95%）和α-姜烯（9.77%）平均相对含量相对较高，这5种挥发性有机化合物在薇甘菊叶片中相对含量达71.63%（表2）。

2.2 自然环境因素对不同地理种群薇甘菊叶片主要挥发性有机化合物含量的线性混合模型分析

运用线性混合模型分析采样地自然环境因素对薇甘菊叶片挥发性有机化合物含量的影响，分别以薇甘菊叶片中平均相对含量较高的5种挥发性有机化合物β-荜澄茄油烯、β-石竹烯、α-古芸烯、大香叶烯D和α-姜烯的百分比标准化后作为协变量，地理和气候因素作为自变量，种群作为随机因子进行分析。结果显示，薇甘菊不同地理种群所在地的经度、纬度和年平均降水量可显著影响其叶片中β-荜澄茄油烯、β-石竹烯、α-古芸烯、大香叶烯D和α-姜烯的含量。同时，海拔高度可显著影响薇甘菊叶片中α-姜烯的含量；温度可显著影响薇甘菊叶片中β-石竹烯的含量（表3）。

2.3 薇甘菊叶片挥发性有机化合物与区域关联分析

为综合分析不同地理种群薇甘菊叶片挥发性有机化合物的变化，对比研究了不同地理种群薇甘菊叶片中含量较多的5种化合物β-荜澄茄油烯、β-石竹烯、大香叶烯D、α-古芸烯和α-姜烯百分比含量的差异，薇甘菊叶片中5种主要挥发性有机化合物与区域关联分析如图 1所示，结果发现β-Caryophyllene在河源（HYU）、梅州（MZH）、肇庆（ZQI）、云浮（YFU）、汕头（STO）和潮州（CZH）的薇甘菊样品中相对含量分别为 64.8%、62.1%、59.0%、55.1%、48.8%和44.9%；β-Cubebene在海口（HKO）、佛山（FSH）、清远（QYU）、湛江（ZJI）、惠州（HZH）和东莞（DGU）的薇甘菊样品中相对含量分别为71.5%、64.0%，61.9%、60.4%、58.2%和 56.8%；α-Gurjunene在肇庆（ZQI）、云浮（YFU）、深圳（SZH）、珠海（ZHA）、阳江（YJI）和揭阳（JYA）的薇甘菊样品中相对含量分别为 35.0%、32.6%、22.3%、19.7%、19.5%和18.1%；Germacrene D在梅州（MZH）、河源（HYU）、汕头（STO）、琼海（QHA）、广州（GZH）、深圳（SZH）的薇甘菊样品中相对含量分别为34.4%、33.3%、28.6%、26.2%、26.0%和24.4%；α-Zingiberene在阳江（YJI）、深圳（SZH）、中山（ZSH）、琼海（QHA）、珠海（ZHA）和儋州（DZH）的薇甘菊样品中相对含量分别为39.8%、29.4%、29.2%、26.4%、25.9%和25.7%。结果表明薇甘菊叶片中5种主要挥发性有机化合物在不同种群中的含量具有明显的地域特征。

2.4 不同地理种群薇甘菊叶片挥发性有机化合物的主成分分析

为评价不同地理种群薇甘菊叶片挥发性有机化合物的差异，对薇甘菊含量较多的5种挥发性有机化合物峰面积进行主成分分析。分别得到对应于2个最大特征的主成分PC1和PC2，其中PC1贡献率为42.7%，PC2贡献率为33.8%；这两个主成分的累计贡献率达76.5%；以第一和第二主成分建立坐标系，进行投影即可得到所有样本的 PCA得分图和载荷图（图 2）。得分图可用来区分样本，载荷图可用来分析变量对样本分类所起的作用。从图中可看出，不同地理种群的薇甘菊得到很好地区分，同时地理距离较近的薇甘菊样品挥发物有机化合物的组分相似；其中β-石竹烯（β-Caryophyllene）和大香叶烯D（Germacrene D）对第一主成分贡献较大；β-荜澄茄油烯（β-Cubebene）、α-古芸烯（α-Gurjunene）和α-姜烯（α-Zingiberene）对第二主成分贡献较大。

表2 薇甘菊叶片挥发性有机化合物相对含量Table 2 Relative percentage of volatile organic compounds from Mikania micrantha

表3 薇甘菊种群的自然环境因素对其叶片中5种挥发性有机化合物的线性混合模型分析Table 3 Linear mixed effect models of natural environmental factors on the four volatile organic compounds from Mikania micrantha

图1 薇甘菊种群的采样位置及其叶片中5种主要挥发性有机化合物在不同地理种群中的比例Fig.1 Sampling sites and proportions of five main volatile organic compounds in the leaves of Mikania micrantha at different geographical populations

图2 不同地理种群薇甘菊叶片挥发性有机化合物的主成分分析Fig.2 Principal component analysis of volatile organic compounds in leaves of M.micrantha from different geographical populations

2.5 不同地理种群薇甘菊叶片挥发性有机化合物的聚类分析

图3 不同地理种群薇甘菊叶片挥发性有机化合物的聚类分析Fig.3 Cluster analysis of volatile organic compounds in M. micrantha leaves from different geographical populations

为比较不同地理种群薇甘菊叶片挥发性有机化合物的差异，以含量较多的5种化合物β-荜澄茄油烯、β-石竹烯、大香叶烯D、α-古芸烯和α-姜烯为指标，对不同地理种群的薇甘菊进行聚类分析。由聚类分析结果可知，23个不同地理种群的薇甘菊可以分为三大类群（图3）。第一类群为河源（HYU）、梅州（MZH）、汕头（STO）、肇庆（ZQI）、云浮（YFU）和潮州（CZH），这一类薇甘菊样品中β-石竹烯的相对含量较高；第二类群为江门（JME）、儋州（DZH）、阳江（YJI）、珠海（ZHA）、中山（ZSH）、深圳（SZH）和琼海（QHA），这一类薇甘菊样品中α-姜烯和β-荜澄茄油烯的相对含量较高；第三类群为东莞(DGU)、清远（QYU）、惠州（HZH）、茂名（MMI）、汕尾（SWE）、湛江（ZJI）、揭阳（JYA）、佛山（FSH）、海口（HKO）和广州（GZH），这一类薇甘菊样品中β-荜澄茄油烯的相对含量较高。

3 讨论与结论

3.1 讨论

研究表明外来入侵植物可通过植株挥发、淋溶、根系分泌或凋落物分解向周围环境释放化学物质从而对邻近植物生长产生影响（Ismail et al.，1996；Callaway et al.，2004；Wang et al.，2011；王伯荪等，2003；李鸣光等，2012）。外来入侵植物的化感作用是其成功入侵的作用机制之一（Callaway et al.，2004）。研究表明薇甘菊叶片挥发物可促进薇甘菊的生物入侵，并对其进行化学成分分析（张茂新等，2003；冯惠玲等2004；王瑞龙等，2012）。如张茂新等（2003）利用GC-MS从薇甘菊花期地上部分挥发油中鉴定了 22种化合物，其中α-长蒎烯（9.5%）、α-律草烯（α-Humulene，7.8%）、β-雪松烯（7.1%）和姜黄烯（Curcumene，6.3%）的含量相对较多。冯惠玲等（2004）从深圳薇甘菊茎、叶精油中鉴定了51种化合物，主要成分为β-澄椒烯（12.87%）、异松油烯（Terpinolene，12.32%）和β-石竹烯（9.49%）。孙盟等（2013）从薇甘菊叶片精油中鉴定出 56种化合物，发现β-澄椒烯（17.44%）、反-罗勒烯（trans-Ocimene，8.93%）和β-石竹烯（8.39%）的含量相对较多。同时 Bravo-Monzón et al.（2014）利用GC-MS分析了太平洋和墨西哥湾热带流域中14个种群的165个薇甘菊样本的叶片挥发性有机化合物的组分，发现在薇甘菊叶片中挥发性有机化合物主要成分为大香叶烯 D（35.6%）、β-石竹烯（9.8%）、柠檬烯（7.1%）和α-蒎烯（7.0%）（Bravo-Monzón et al.，2014）。本文采用Bravo-Monzón et al.（2014）相似的方法，运用GC-MS分析华南地区23个不同地理种群230个薇甘菊个体的叶片挥发性有机化合物的变化，结果鉴定了 42种化合物（表 2），其中β-荜澄茄油烯（24.63%）、β-石竹烯（16.81%）、大香叶烯 D（10.47%）、α-古芸烯（9.95%）和α-姜烯（9.77%）的相对含量较高。通过对比分析可知，薇甘菊叶片的挥发性有机物的组分在原产地（墨西哥）和入侵地（中国）存在较大差异，而且在入侵地不同的地理种群薇甘菊叶片的挥发性有机物的组分具有明显的地域特征。表明从种群水平发现薇甘菊叶片挥发性萜类化合物组分的变化遵循一种镶嵌模式，在该模式中地理因素即自然屏障具有一定作用（Bravo-Monzón et al.，2014）。

研究表明外来入侵生物可通过调节其自身生理代谢途径来加速入侵进程（Inderjit et al.，2011；Wang et al.，2012；Alba et al.，2012）。入侵植物紫茎泽兰（Ageratina adenophora）通过释放挥发性有机化合物可影响入侵地邻近植物种子的萌发和幼苗生长。紫茎泽兰体内的挥发性有机化合物的组成在入侵地和原产地发生了变化，在入侵地（中国、印度）对土著植物表现出强烈的抑制作用，而在原产地（墨西哥）对土著植物的抑制作用较弱。表明紫茎泽兰入侵与其体内挥发性有机化合物的生理代谢变化相关，从而促进了紫茎泽兰的入侵（Inderjit et al.，2011）。同理入侵植物毛蕊花（Verbascum thapsus）在入侵美国后，其体内的环烯醚萜苷类（iridoid glycosides）化学防御物质的分布发生了显著性变化，在入侵地美国，毛蕊花新叶中的环烯醚萜苷类含量比老叶高6.5倍；而在原产地欧洲，毛蕊花新叶比老叶仅高2倍，表明在入侵地中毛蕊花通过生理响应重新分配资源物质来优先保护新叶（Alba et al.，2012）。比较乌桕（Triadica sebifera）原产地种群（中国）和入侵地种群（美国）的两大类化学防御物质的差异，发现入侵种群的类黄酮含量显著高于原产地种群，而入侵种群的单宁含量则显著低于原产地种群，不同类型的化学防御物质间存在权衡，表明乌桕通过调节生理代谢过程在入侵地提高了入侵竞争能力（Wang et al.，2012）。本研究发现薇甘菊在华南地区的入侵地其挥发性有机化合物的组分在不同地理种群间也存在显著的差异，并表现出明显的地域特征（图 1），同时入侵地的环境因素如纬度、海拔高度等可显著影响薇甘菊叶片挥发性有机化合物的组分。

外来入侵植物在扩散过程中，面临的生物和非生物环境发生了很大的变化，其中非生物环境的变化与入侵种的入侵速率及入侵区域密切相关（Pellissier et al.，2014；Cronin et al.，2015；Abdala-Roberts et al.，2016）。通过分析横跨20个纬度17个入侵地的芦苇叶片中总酚含量的变化，发现芦苇叶片中总酚含量在原产地和入侵地均不随纬度发生变化，但总酚的含量在入侵地更高（Cronin et al.，2015）。长叶车前（Plantago lanceolata）叶片中环烯醚萜苷的含量随海拔高度的增加而下降（Pellissier et al.，2014）。但是夏栎（Quercus robur）叶片中酚类物质的含量随着海拔高度的增加而增加（Abdala-Roberts et al.，2016）。比较分析不同纬度蓝花草（Ruellia nudiflora）叶片中酚类物质的含量与环境因素的响应，发现蓝花草叶片中酚类物质的含量与降水呈负相关关系，而叶片中酚类植物的含量与纬度不相关（Abdala-Roberts et al.，2016）。研究表明温度变化可改变薇甘菊叶片中挥发性有机化合物的组分；与22 ℃相比，30 ℃时薇甘菊叶片中挥发性有机化合物α-古巴烯、α-法尼烯、α-葎草烯、α-柏木烯和β-姜烯的相对含量分别显著增加了305.4%、37.6%、16.1%、31.1%和76.5%，同时温度升高（30 ℃）增强了薇甘菊叶片挥发物对萝卜（Raphanus sativus）和油菜（Brassica campestris）的根长和苗高生长的抑制作用，表明温度升高可增强薇甘菊叶片挥发物对受体植物的抑制作用，从而促进薇甘菊的生物入侵（王瑞龙等，2012）。同时温度升高显著改变入侵植物五爪金龙（Ipomoea cairica）生物量分配模式的变化，即促进了其茎的生长和增加了茎的生物量分配，有利于占据更大的生存空间，进一步加剧其入侵（Wang et al.，2011）。水分胁迫可影响薇甘菊体内化感物质的生物合成，增加了土壤中化感物质的含量，增强薇甘菊入侵土壤对受体植物生长的抑制作用，薇甘菊对水分胁迫具有较强的适应性，这可能是其成功入侵的原因之一（Wang et al.，2016）。本研究运用线性混合模型分析了采样地自然环境因素对薇甘菊叶片挥发性有机化合物含量的影响，结果显示采样地经度、纬度和年平均降水量可显著影响薇甘菊叶片中β-荜澄茄油烯、β-石竹烯、α-古芸烯、大香叶烯D和α-姜烯的含量；同时所在地的海拔高度可显著影响薇甘菊叶片中α-姜烯的含量；温度也可显著影响薇甘菊叶片中β-石竹烯的含量（表3）。

3.2 结论

本研究结果表明，华南地区薇甘菊 23个不同地理种群230个植株的叶片挥发性有机化合物以β-荜澄茄油烯、β-石竹烯、α-古芸烯、大香叶烯D和α-姜烯等5种化合物为主。不同地理种群的薇甘菊叶片挥发性有机化合物的化学成分基本一致，但有效成分含量存在差异；且受到采样地经度、纬度、海拔高度和温度等环境因素的影响，进而表现出较强的地域特征。未来需深入研究华南地区不同地理种群的薇甘菊叶片水浸提液、叶片挥发物和凋落物等对受体植物（特别是伴生的土著植物）的化感作用，揭示不同地理种群的薇甘菊叶片挥发性有机化合物的变化对薇甘菊种间竞争能力及其入侵能力的影响。本研究可为揭示薇甘菊在中国的入侵态势及其入侵扩散机制、预测气候变化条件下入侵植物地理格局变化及其防控措施制定提供科学指导和实践参考。