何明静，黄世杰，孙祥琳，韦 俊，周 茜，陈力嘉

(1.攀枝花学院医学院解剖教研室，四川 攀枝花 617000；2.攀枝花学院康养学院，四川 攀枝花 617000)

冠状动脉粥样硬化性心脏病(coronary atherosclerotic cardiopathy)简称冠心病，其常见症状是心肌缺血(myocardial ischemia)，极易造成死亡，威胁人类生命安全[1]。严重的缺血会诱导细胞死亡机制的激活，如坏死、细胞凋亡和自噬[2]。自噬和细胞凋亡在调节心血管疾病中起重要作用[3]。自噬与细胞凋亡的关系十分复杂，自噬的激活既可以抑制也可以促进细胞凋亡[4-5]。熊果酸是一种五环三萜类化合物，已有大量文献报道其有抗肿瘤[6-8]、降血糖血脂[9]、抗菌[10]以及抗氧化[11-12]的功效。已有报道称，熊果酸对缺血再灌注损伤的H9c2细胞具有保护作用[13]。在癌症领域中，国内外均有研究表明熊果酸促进癌细胞的自噬以达到抗癌作用[14-17]。然而，熊果酸对心肌缺血后自噬的作用未见报道，故本研究采用血清剥夺的方法模拟心肌缺血，构建心肌缺血体外模型，以自噬的角度探讨熊果酸对心肌细胞的保护机制。

1 材料和方法

1.1 实验材料

大鼠H9c2心肌细胞购自普诺赛生命科技有限公司(武汉，中国)。

1.2 主要试剂

DMEM/F12培养基、胎牛血清购自HyClone公司(美国)；青链霉素双抗、PBS缓冲液购自Gibco公司(美国)；熊果酸(U6753)、3-甲基腺嘌呤(3-MA)(M9281)、雷帕霉素(R0395)购自Sigma-Aldrich公司(美国)；Annexin V-APC/PI凋亡检测试剂盒(ECK-A217)购自伊莱瑞特生物科技股份有限公司(武汉，中国)；ECL试剂盒购自索莱宝科技有限公司(北京，中国)；RIPA裂解液购自碧云天生物技术有限公司(上海，中国)；蛋白质定量(Bicinchoninic Acid，BCA)试剂盒购自Thermo Fisher公司(美国)；LC3兔多克隆抗体(ab48394)、Beclin1兔多克隆抗体(ab62557)、ATG5兔单克隆抗体(ab108327)、BcL-2兔多克隆抗体(ab59348)、Bax兔单克隆抗体(ab32503)、cleaved-caspase3兔多克隆抗体(ab49822)、β-actin兔多克隆抗体(ab5694)以及山羊抗兔IgG H＆L(HRP)二抗(ab205718)均购自Abcam公司(英国)。

1.3 实验方法

1.3.1 细胞培养及分组

大鼠H9c2心肌细胞用DMEM/F12培养基进行培养，并补充10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和0.1 mg/mL的链霉素，培养箱条件为37℃，5% CO2。每2 d换液1次，当细胞生长至80%融合时传代。分组情况如下:(a)对照组:继续采用含10%胎牛血清、双抗的培养基培养。(b)剥夺血清组:根据参考文献[18]，用无血清的DMEM/F12培养基培养24 h。(c)熊果酸组:为了确定熊果酸的适合浓度，在含10%胎牛血清、双抗的培养基的条件下，使用0、5、10、20、40μmol/L熊果酸预处理细胞，筛选出合适浓度后，再用含合适浓度熊果酸的无血清DMEM/F12培养基培养24 h。(d)熊果酸+3-MA处理组:根据参考文献[19]使用10μmol/L 3-MA预处理细胞2 h，再用含合适浓度熊果酸的无血清DMEM/F12培养基处理细胞24 h。(e)熊果酸和雷帕霉素处理组:根据参考文献[20]，使用100μmol/L雷帕霉素预处理细胞2 h，再用含合适浓度熊果酸的无血清DMEM/F12培养基处理细胞24 h。

1.3.2 蛋白免疫印迹分析

用预冷的PBS缓冲液洗涤细胞，用裂解液裂解30 min，在4℃以11 000 r/min离心10 min。随后，参照说明书使用BCA测定法测量蛋白质浓度。通过10%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质样品。随后将蛋白质转移到PVDF膜上。在室温下用5%脱脂乳封闭膜1 h，并用LC3、Belin、ATG5、BcL-2、Bax、cleaved-caspase3、β-actin一抗孵育，4℃过夜，再用山羊抗兔IgG H＆L(HRP)二抗在室温下孵育1 h，洗膜后经ECL试剂盒显影，使条带可视化，再使用Image-ProPlus 6.0软件对条带进行定量分析。

1.3.3 Annexin V-APC/PI双染法流式细胞术检测细胞凋亡

H9c2细胞经PBS洗涤后，用胰酶消化并离心，PBS重悬细胞，取1×105细胞重悬细胞，离心后弃上清，再用PBS洗涤细胞1次，离心弃上清后加入500 μL的1×Annexin V Binding Buffer重悬细胞。随后分别加入5μL Annexin V-APC和5μL PI，4℃避光孵育15 min。反应完成后，用1 mL PBS洗涤1次，使用FACSCaliburTM流式细胞仪(BD Biosciences，美国)检测细胞凋亡。

1.4 统计学方法

应用SPSS 20.0软件进行统计学分析，计数资料以平均数±标准差(±s)表示，统计采用单因素方差分析，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 不同浓度熊果酸处理对H9c2细胞的影响

实验采用0、5、10、20、40μmol/L熊果酸处理正常培养的H9c2细胞，用流式细胞术检测细胞凋亡情况，实验结果如图1所示。与空白对照组相比，20、40μmol/L熊果酸处理组细胞凋亡率上升(P＜0.001)，10μmol/L处理组与空白对照组凋亡率差异不显著，因此后续实验采用10μmol/L熊果酸处理H9c2细胞。

2.2 熊果酸减轻血清剥夺H9c2细胞造成的自噬

为研究熊果酸是否能影响H9c2细胞血清剥夺介导的自噬，用10μmol/L熊果酸预处理H9c2细胞1 h，再在血清剥夺的情况下培养24 h，然后检测自噬相关蛋白的表达，结果如图2。与对照组相比，血清剥夺自噬相关蛋白ATG5、Beclin1表达量极显著上升(P＜0.001)，LC3II/I的比值显著上升(P＜0.01)。而熊果酸处理组有效的降低了ATG5、Beclin1的表达(P＜0.001)以 及LC3II/I的 比值(P＜0.05)。

2.3 熊果酸通过抑制自噬减轻了血清剥夺诱导的H9c2细胞凋亡

注:与0μmol/L组相比，***P＜0.001。图1 不同浓度熊果酸对H9c2细胞凋亡率的影响Note.Compared with 0μmol/L group，***P＜0.001.Figure 1 Effects of different concentrations of ursolic acid on the apoptosis rate of H9c2 cells

为了探讨H9c2细胞血清剥夺后自噬与凋亡的关系，运用流式细胞术检测熊果酸处理血清剥夺的H9c2细胞的凋亡情况，并分别运用自噬的抑制剂3-MA和自噬的激活剂雷帕霉素联合熊果酸处理血清剥夺的H9c2细胞，观察细胞凋亡的变化，结果如图3所示。与对照组相比，血清剥夺组凋亡率极显著上升(P＜0.001)，熊果酸处理组降低了凋亡率(P＜0.01)，熊果酸联合3-MA组进一步降低了凋亡率(P＜0.001)，而雷帕霉素的处理消除了熊果酸的抗凋亡作用。

注:A:ATG5、Beclin1、LC3I、LC3II的蛋白免疫印迹图；B:ATG5的相对表达量；C:Beclin1的相对表达量；D:LC3 II/I的比值，***P＜0.001，**P＜0.01，*P＜0.05，下同。图2 熊果酸处理后，H9c2细胞ATG5、Beclin1表达水平以及LC3II/I比值变化Note.A，Western blot assay of ATG5，Beclin1，LC3I，LC3II andβ-actin.B，Relative expression of ATG5.C，Relative expression of ATG5.D，Ratio of LC3II/I，***P＜0.001，**P＜0.01，*P＜0.05，the same as bellow.Figure 2 Changes of ATG5，Beclin1 expression levels and LC3II/I ratio in H9c2 cells after ursolic acid treatment

图3 熊果酸对H9c2细胞血清剥夺后的抗凋亡作用以及自噬被抑制或增强后熊果酸抗凋亡作用的变化Figure 3 Anti-apoptotic effect of ursolic acid on serum deprivation of H9c2 cells，and changes of the anti-apoptotic effect of ursolic acid after autophagy is inhibited or enhanced

2.4 熊果酸通过增加BcL-2的表达，降低Bax、cleaved-caspase3的表达起抗凋亡作用

为了进一步探讨熊果酸抑制自噬后的抗凋亡机制，运用蛋白免疫印迹试验(Western blot)检测凋亡相关蛋白BcL-2、Bax、cleaved-caspase3的表达，结果如图4所示。与对照组相比，剥夺血清组BcL-2表达量极显著下降(P＜0.001)，cleaved-caspase3、Bax表达量以及Bax/BcL-2比值显著上升(P＜0.001)；熊果酸处理使BcL-2表达量回升(P＜0.01)，cleaved-caspase3、Bax表达量以及Bax/BcL-2比值下降(P＜0.01)；熊果酸联合3-MA进一步使BcL-2表达量回升(P＜0.001)，使cleaved-caspase3表达量以及Bax/BcL-2比值下降(P＜0.001)；雷帕霉素干预后Bax/BcL-2的比值回升(P＜0.05)(图4C～4F)。

3 讨论

伴随着我国经济发展和人们生活方式的改变以及老龄化人口的增加，冠心病发病率呈上升趋势[21]。冠心病容易引起心肌缺血，造成心肌能量代谢紊乱，可能造成心绞痛、心肌梗死、缺血性心肌病甚至猝死，严重威胁人类生命健康[22]。早期研究发现，心肌缺血会导致自噬[23]。本研究采用血清剥夺来模拟体外心肌缺血，该方法已被报道用于心肌缺血的机制研究[18，24-25]。在本研究中，再次证实了剥夺血清来模拟心肌缺血会造成H9c2细胞自噬程度增加。

越来越多的报道表明，干预自噬可以保护心肌缺血造成的损伤。一直以来，自噬对心肌缺血起保护作用还是损害作用存在争议，自噬对心肌缺血的作用尚未完全阐明[26]。Kanamori等[27]运用巴弗洛霉素A1抑制自噬，发现抑制自噬后增加了动物模型心肌梗死面积，表明自噬是一种先天性和有效的过程，可以保护心肌细胞免于急性心肌梗死时的缺血性死亡。Li等[28]人发现阿托伐他汀能够激活AMPK/mTOR途径诱导自噬并抑制细胞凋亡，从而改善了缺血心肌面积和功能。然而，在严重缺血的情况下，心脏的过度自噬可能促进心肌细胞死亡并使心脏功能恶化[29]。Zhang等[30]提出，在心肌缺血或梗塞过程中，缺氧诱导的损伤通过诱导细胞凋亡和过度自噬过程成为心脏损伤的主要因素之一。Liu等[31]发现，外泌体转运的miR-93-5p通过靶向ATG7抑制自噬和炎性因子的表达，在急性心肌梗塞的动物模型和体外模型中对心肌细胞发挥保护作用。Jia等[2]指出，黄连素(小檗碱)可以抑制过度自噬，从而使缺氧的大鼠H9c2细胞存活。Pattingre等[32]早前提出，自噬是体内平衡的必要条件，是对营养缺乏和其他形式细胞应激的适应性反应。然而，如果自噬水平被诱导超过生理范围，自噬可能导致死亡执行。

注:A:BcL-2、Bax、cleaved-caspase3蛋白免疫印迹条带图；B:BcL-2相对表达量；C:Bax相对表达量；D:BcL-2/Bax比值；E:cleaved-caspase3相对表达量。图4 熊果酸处理对H9c2细胞血清剥夺后的凋亡相关蛋白表达变化Note.A，Western blot assay of BcL-2，Bax and cleaved-caspase3.B，Relative expression of BcL-2.C，Relative expression of Bax.D，Ratio of Bax/BcL-2.E，Relative expression of cleaved-caspase3.Figure 4 Expressions of apoptosis-related proteins after serum deprivation of H9c2 cells by ursolic acid treatment

熊果酸是广泛存在于各种天然植物中的五环三萜类化合物，已经被证明具有抗肿瘤、降血糖血脂、抗感染、抗氧化等作用[6-12]。近几年，已有研究表明熊果酸对心肌缺血以及心肌缺血再灌注造成的损伤具有保护作用。王佳等[33]发现熊果酸能抑制氧化应激损伤和脂代谢紊乱，从而改善心肌免受心肌梗死损伤。赵瑞芳[34]则指出熊果酸同样能改善心肌缺血再灌注造成的心肌损伤，其机制也与抑制氧化应激损伤有关。在熊果酸影响细胞自噬方面，大多集中在癌症研究领域。卢文等[14]通过实验表明，熊果酸通过增强自噬抑制了宫颈癌细胞的增殖。罗敏等[15]则发现熊果酸处理人肺癌PC9细胞后，自噬相关蛋白ATG5表达升高，LC3II/I比值升高，说明熊果酸增加了PC9细胞的自噬，并抑制了PC9细胞的增殖。然而，关于熊果酸在保护心肌细胞缺血损伤时，是否通过自噬产生作用还未见报道。本研究发现，加入熊果酸后，自噬相关蛋白ATG5、Beclin1表达量降低，LC3II/I比值也降低，表明自噬被抑制。接下来检测了H9c2细胞的凋亡情况，发现加入熊果酸后，H9c2细胞凋亡率降低，再次证明熊果酸对缺血心肌细胞有保护作用，且推测熊果酸对H9c2细胞的抗凋亡作用可能与自噬被抑制有关。为了进一步验证熊果酸对H9c2细胞的抗凋亡作用与自噬相关，本研究选用了自噬抑制剂3-MA和自噬激动剂雷帕霉素分别联合熊果酸处理H9c2细胞，发现熊果酸联用3-MA进一步降低细胞凋亡率，而熊果酸联用雷帕霉素使凋亡细胞增多，推测血清剥夺会造成H9c2细胞自噬，且超出其生理水平，引发细胞凋亡，熊果酸可以抑制这种过度自噬，保护H9c2细胞。

为了进一步验证熊果酸通过抑制自噬对H9c2细胞的抗凋亡机制，本研究检测了BcL-2、Bax以及cleaved-caspase3的蛋白表达量。BcL-2家族是线粒体凋亡途径的有效调节蛋白家族，该家族包括了抗凋亡蛋白BcL-2和促凋亡蛋白Bax。Bax和BcL-2的比例已被用作代表凋亡效应的标志[35]。Caspase3是介导细胞凋亡的caspase蛋白家族的成员之一，caspase3被剪切为cleaved-caspase3后激活并导致细胞凋亡[36]。本研究发现，与血清剥夺组相比，熊果酸处理和熊果酸联用3-MA组Bax/BcL-2比值和cleaved-caspase3表达明显降低。这表明熊果酸通过增加抗凋亡蛋白BcL-2和降低促凋亡蛋白Bax、cleaved-caspase3表达发挥抗凋亡作用，自噬进一步被抑制后，抗凋亡作用进一步增强。而用雷帕霉素激活自噬后，熊果酸的抗凋亡作用被削减。

Pattingre等[32]认为BcL-2能与Beclin1结合从而抑制Beclin1介导的自噬，Beclin1和BcL-2家族蛋白的相对含量决定了从细胞存活到细胞死亡的转变。Xu等[37]发现，过表达BcL-2或敲低Beclin1表达可以限制自噬的过度激活，并在营养剥夺胁迫下防止细胞凋亡。故本研究推测熊果酸的抑制自噬和抗凋亡作用可能与改变BcL-2和Beclin1的相对含量有关。

综上，本研究通过体外实验探究了熊果酸在心肌缺血过程中凋亡与自噬的保护作用及其机制，并证实熊果酸对剥夺血清的心肌细胞的抗凋亡作用与抑制其过度自噬有关，后续还需要体内实验进行验证。