陈苏丹，汪亚祺，李秀珍，李学强

(河南科技大学 林学院，河南 洛阳 471023)

0 引言

款冬(TussilagofarfaraL.)为菊科千里光族款冬属的多年生药用草本植物，别名冬花、看灯花、九九花等，是中国传统的中药材[1]。款冬以花蕾入药，其性温味辛，具有润肺下气、化痰止咳[2]的功效。临床用于治疗咳嗽痰多、新久咳嗽、支气管炎、肺结核和咳吐脓血等症[3]，药用价值突出。

近年的研究表明：款冬的主要化学成分有萜类、黄酮类、多糖、有机酸、挥发油和生物碱类等[4]。其中，款冬中的黄酮类化合物含量较高且种类丰富[5]，主要以苷类形式存在，具有抗菌消炎、抗氧化、抗病毒、抗肿瘤、清热解毒、降压、利尿、强心镇静和镇痛等多种药理活性[6]，是款冬发挥药效的一种重要生物活性成分[7]。目前，对款冬总黄酮的研究多集中于分离纯化[8-9]、含量测定[10]、微波法辅助提取[11]、提取优化及降脂作用[12]等方面，而利用超声辅助法提取款冬总黄酮的报道很少。由于超声波具有特殊的生物效应，选择合适的超声参数能使植物的细胞壁间形成较多的小孔[13]，从而增强细胞膜的通透性及选择性[14]，现已广泛用于提取植物中的生物活性成分[15]。本文采用超声辅助法提取款冬总黄酮，并对其体外抗氧化活性进行初步研究，以期为款冬的充分开发与利用提供理论依据。

1 材料与方法

试验材料为款冬花蕾，于2019年1月在河南省三门峡市卢氏县采集，将花蕾去除花梗和泥沙，阴干。粉碎后过60目筛，干粉备用。亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH·)、维生素C、无水乙醇、浓盐酸、硫酸亚铁、三羟甲基氨基甲烷(Tris)等试剂均为国产分析纯，芦丁标准品为色谱纯，购自中国食品药品检定研究院。

1.1 标准曲线的绘制

准确称取2.5 mg芦丁标准品，用体积分数为70%的乙醇定容至25 mL，得0.1 mg·mL-1的芦丁溶液。分别移取芦丁溶液0 mL、1 mL、2 mL、3 mL、4 mL和5 mL置于10 mL试管中，加入5%(质量分数)亚硝酸钠溶液0.5 mL后静置6 min；加入10%(质量分数)硝酸铝溶液0.5 mL后静置6 min；加入4%(质量分数)氢氧化钠溶液4 mL，用70%(体积分数)乙醇溶液定容后静置15 min。以不加芦丁标准品的溶液为空白对照。在波长510 nm处测定样品的各吸光值[16]，以芦丁质量浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线，得线性回归方程为Y=18.711X-0.000 3，r2=0.999 1，表明芦丁在0.008 3～0.047 9 mg·mL-1线性关系良好，可用于款冬总黄酮质量浓度的测定。

1.2 款冬总黄酮提取率的测定

精密称取0.5 g款冬花蕾粉末置于50 mL的三角瓶中，在所设定的条件下进行超声(超声功率500 W)辅助提取，提取完成后趁热过滤，滤渣冲洗3次，滤液置于100 mL容量瓶中，用70%(体积分数)乙醇定容，得供试液，在波长510 nm处测定吸光值。按以下公式计算款冬总黄酮提取率：

(1)

其中：C为根据标准曲线计算出的款冬总黄酮质量浓度，mg·mL-1；N为稀释倍数；V为定容体积，mL；M为款冬花蕾干粉的的质量，g。

1.3 款冬总黄酮提取工艺的单因素试验

在超声时间分别为10 min、20 min、30 min、40 min和50 min的条件下比较提取效果，超声温度为50 ℃，乙醇体积分数为70%，料液比(体积比，下同)为1∶35。确定超声时间为40 min的提取效果较好后，在超声温度分别为30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃和70 ℃的条件下比较提取效果，乙醇体积分数为70%，料液比为1∶35。确定超声温度为50 ℃的提取效果较好后，在料液比分别为1∶20、1∶25、1∶30、1∶35和1∶40的条件下比较提取效果，乙醇体积分数为70%，超声时间为40 min。确定料液比为1∶35的提取效果较好后，选择在乙醇体积分数分别为50%、60%、70%、80%和90%的条件下比较提取效果，超声时间为40 min，超声温度为50 ℃，从而确定各因素的最佳水平。

1.4 款冬总黄酮提取工艺的正交试验

根据单因素试验结果，选择乙醇体积分数(A)、料液比(B)、超声温度(C)和超声时间(D)为考察因素，以款冬总黄酮的提取率为评价指标，采用正交试验L9(34)选取最优提取工艺条件。正交试验因素与水平见表1。

表1 正交试验因素与水平

1.5 方法重现性试验

为进一步验证经过数据方差分析所得的最优工艺条件的稳定性和可靠性，在最优工艺条件下进行款冬总黄酮提取率测定试验，同时做5个平行样品，计算相对标准偏差。

1.6 款冬总黄酮的抗氧化活性研究

分别配制质量浓度为0.02 mg·mL-1、0.03 mg·mL-1、0.04 mg·mL-1、0.05 mg·mL-1和0.06 mg·mL-1的款冬总黄酮提取液，参照文献[17-19]，测定其对DPPH·、羟基自由基(·OH)和超氧阴离子自由基(O2-·)的清除能力。

1.7 数据分析

所有试验均进行3次重复，结果取平均值，数据采用Microsoft Excel 2010和SPSS20软件分析处理。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果分析

2.1.1 超声时间对款冬总黄酮提取率的影响

超声时间对款冬总黄酮提取率的影响见图1。由图1可知：超声时间为10～40 min时，款冬总黄酮提取率的增加较为明显。当超声时间为40 min时，款冬总黄酮的提取率最高，为6.59%。当超声时间为50 min时，款冬总黄酮提取率下降至5.48%。可能原因是：超声时间较短时，款冬总黄酮提取不充分；延长超声时间，款冬总黄酮则不断地溶出并进入溶液，从而提高了提取率。但经过一定的提取时间后，款冬总黄酮已基本溶出，若超声时间过长，会使款冬中大量非黄酮类物质溶出，导致总黄酮的提取率降低，耗能增加。

2.1.2 超声温度对款冬总黄酮提取率的影响

超声温度对款冬总黄酮提取率的影响见图2。由图2可以看出：在超声温度为30～50 ℃时，随着超声温度的提高，款冬总黄酮的提取率逐渐增加，从4.41%升高至6.06%。而超声温度进一步升高到60 ℃和70 ℃时，款冬总黄酮提取率则呈下降趋势。分析其原因，可能是总黄酮在乙醇溶液中的溶解度随着超声温度的升高而增加，当温度升高时，分子运动会加快，扩散速率增加，使得总黄酮的提取率增加。但超声温度过高时，会破坏总黄酮的结构，使总黄酮的活性受到影响，同时增加了非黄酮类物质的溶出量，因此，造成款冬总黄酮的提取率下降。

图1 超声时间对款冬总黄酮提取率的影响

图2 超声温度对款冬总黄酮提取率的影响

2.1.3 料液比对款冬总黄酮提取率的影响

料液比对款冬总黄酮提取率的影响见图3。由图3可知：在料液比为1∶20～1∶35时，随着料液比的减小，款冬总黄酮的提取率呈增加趋势，说明溶剂用量的增多有利于款冬黄酮类物质的溶出。当料液比为1∶35时，款冬总黄酮提取率最大，为6.68%。之后，随着溶剂用量进一步增加，料液比为1∶40时，款冬总黄酮提取率下降为6.23%。分析其原因，可能是由于款冬中的醇溶性与脂溶性杂质溶出量随溶剂用量的增加而增多，影响黄酮类物质的溶出，从而降低款冬总黄酮的提取率。

2.1.4 乙醇体积分数对款冬总黄酮提取率的影响

乙醇体积分数对款冬总黄酮提取率的影响见图4。由图4可知：款冬总黄酮的提取率随着乙醇体积分数的提高而明显增加，当乙醇体积分数为60%时，款冬总黄酮的提取率达到最高，为6.46%。而随着乙醇体积分数继续提高，款冬总黄酮的提取率则不断下降。这表明，在乙醇体积分数较低的情况下，醇溶性物质的溶出量会随着乙醇体积分数的增加而增加，款冬总黄酮提取率也随之增大。但若乙醇体积分数继续增大，款冬中的一些醇溶性和脂溶性杂质溶出量增加，溶液的黏度增大，款冬总黄酮向溶剂中的扩散阻力增大，扩散减慢，提取率下降。

图3 料液比对款冬总黄酮提取率的影响

图4 乙醇体积分数对款冬总黄酮提取率的影响

2.2 正交试验结果与分析

经超声时间、超声温度、料液比和乙醇体积分数等单因素试验，确定款冬总黄酮提取的最优条件，采用L9(34)正交试验法进行试验，正交试验设计与结果分析如表2所示。正交试验的极差(R)表现为A>C>B>D，表明各因素对款冬总黄酮提取率的影响顺序由大到小依次为：乙醇体积分数>超声温度>料液比>超声时间。款冬总黄酮提取的最优工艺条件组合为A3B3C2D3，即乙醇体积分数为70%，料液比为1∶40，超声温度为50 ℃，超声时间为50 min。由于正交试验中没有出现此最优组合，因此要对所得的最优组合进行验证试验。重复5次款冬总黄酮提取率测定试验，测得款冬总黄酮提取率为8.02%，高于表2中最高的总黄酮提取率(7.50%)，相对标准偏差为0.79%，证明该工艺条件稳定可行，适用于款冬总黄酮的提取。

根据方差分析的结果可知：A(乙醇体积分数)和C(超声温度)对款冬总黄酮的提取率有显著影响(P<0.05)，而B(料液比)和D(超声时间)对款冬总黄酮提取率影响不显著。

表2 正交试验设计与结果分析

2.3 款冬总黄酮抗氧化活性分析

图5 款冬总黄酮和维生素C对DPPH·的清除作用

款冬总黄酮和维生素C对DPPH·的清除作用见图5。图5表明：当款冬总黄酮的质量浓度为0.02～0.06 mg·mL-1时，随着款冬总黄酮质量浓度的增大，其对DPPH·的清除率逐渐升高，清除率与款冬总黄酮质量浓度之间存在一定的量效关系。当款冬总黄酮的质量浓度为0.06 mg·mL-1时，对DPPH·的清除率达到最高，为81.03%。虽然款冬总黄酮清除DPPH·的能力稍弱于维生素C清除DPPH·的能力，但款冬总黄酮依旧表现出较强的清除DPPH·的能力，说明所提取的款冬总黄酮具有较好的抗氧化能力。款冬总黄酮和维生素C对·OH的清除作用见图6。由图6可以看出：款冬总黄酮对·OH的清除率随着质量浓度的增加而逐渐增大。当款冬总黄酮的质量浓度为0.06 mg·mL-1时，对·OH的清除率达到最高，为44.59%。尽管款冬总黄酮清除·OH的能力弱于维生素C，但款冬总黄酮也表现出一定的清除·OH的能力。O2-·在活性氧的形成中起重要作用，为防止其造成的氧化损伤，需要加入抗氧化剂对其进行清除。因此，可通过测定抗氧化剂对O2-·的清除能力来判断抗氧化剂的抗氧化能力。款冬总黄酮和维生素C对O2-·的清除作用见图7。由图7可知：款冬总黄酮的质量浓度越大，对O2-·的清除率越高，呈明显的剂量效应关系。当款冬总黄酮质量浓度为0.06 mg·mL-1时，对O2-·的清除率达到最高，为83.34%。与相同质量浓度的维生素C相比，款冬总黄酮清除O2-·的能力虽然稍弱于维生素C，但款冬总黄酮仍表现出较强的清除O2-·的能力。

图6 款冬总黄酮和维生素C对·OH的清除作用

图7 款冬总黄酮和维生素C对O2-·的清除作用

综合分析，当款冬总黄酮质量浓度为0.06 mg·mL-1时，对DPPH·、·OH和O2-·的清除率均达到最高，款冬总黄酮对DPPH·和O2-·具有较强的清除能力，对·OH具有一定的清除能力，说明款冬总黄酮具有良好的抗氧化活性。

3 讨论与结论

款冬总黄酮最优提取工艺条件为乙醇体积分数70%、料液比1∶40、超声温度50 ℃、超声时间50 min。在此工艺条件下，款冬总黄酮提取率为8.02%。文献[12]以产自吉林省临江市的款冬为材料，得到在乙醇体积分数为 80%、料液比 1∶41、超声温度58 ℃、提取时间30 min的条件下，款冬总黄酮提取率最大，为 7.18%，本文的提取率高于该结果。文献[10]研究表明：来自河北、山东、内蒙古、贵州、广西等不同产地的款冬总黄酮提取率为4.2%～8.0%，本文研究结果与此接近。提取率略有不同主要是由于试验所用的款冬来自不同的产地，其总黄酮含量存在差异，这与不同地区的土壤、海拔、生态环境和气候条件等相关。文献[11]采用微波法提取款冬总黄酮，提取率为9.70%，稍高于本文结果，原因可能是除试验材料的来源地不同外，也与提取工艺有关。从整体来看，超声辅助提取具有稳定可靠、快速、便捷、提取率高等特点，适用于款冬总黄酮的提取。

抗氧化试验表明：款冬总黄酮对O2-·和DPPH·具有较强的清除能力，对·OH具有一定的清除能力。当款冬总黄酮质量浓度为0.02～0.06 mg·mL-1时，对3种自由基的清除能力均随款冬总黄酮质量浓度的增加而增强。当款冬总黄酮质量浓度为0.06 mg·mL-1时，对DPPH·、·OH和O2-·的清除率均达到峰值，分别为81.03%、44.59%和83.34%。文献[20]研究表明：刺槐花总黄酮具有较强的抗氧化性，当刺槐花总黄酮质量浓度为0.47 mg·mL-1时，对DPPH·、·OH和O2-·的清除率分别达到88.04%、34.41%和59.07%。文献[21]报道：无花果叶片总黄酮提取液对DPPH·和·OH的清除率分别达到66.67%和30.49%，证明无花果叶片具有较好的体外抗氧化能力。与这些植物的抗氧化能力相比，款冬总黄酮具有很强的体外抗氧化活性，可作为良好的天然抗氧化物质资源进行进一步的开发利用。本研究为款冬的综合开发利用提供了理论基础。