杨金，朱均昊，李莉，章强强

侵袭性真菌病（invasive fungal disease，IFD），是指真菌侵入人体组织、血液，并在其中生长繁殖导致组织损害、器官功能障碍和炎性反应的病理和病理生理改变。随着广谱抗菌药物、

皮质类固醇激素及免疫抑制剂在临床上的广泛应用，IFD发病率呈明显上升趋势。对IFD的早期高效诊断有利于改善疾病的转归。传统的真菌感染检测方法主要有真菌形态学、病理学、分子生物学、免疫学等，但这些方法本身具有各自的局限性，检测耗时久、灵敏度低等并易造成漏诊，常无法满足临床早期诊断要求。近年来，真菌血清学检查（1，3）-β-D葡聚糖检测（G试验）以其无创、快捷、灵敏等优势在真菌早期诊断中发挥重要作用。本研究对复旦大学附属华山医院高度怀疑IFD患者的血清标本作G试验检测，以患者临床诊断结果为依据，并与传统真菌涂片、培养方法及隐球菌荚膜抗原检测结果加以比较，探究G试验联合真菌涂片、真菌培养及隐球菌荚膜抗原检测等微生物学检测在IFD诊断中的临床意义。

1 材料与方法

1.1 病例来源

收集2018年2－12月我院普外科、胸外科、泌尿外科、感染科、血液科、肾内科、神经内科、呼吸科等8个科室高度怀疑IFD住院患者，住院期间进行G试验，以及血液、无菌体液、组织置换液和合格痰标本进行真菌涂片、真菌培养。

1.2 IFD判定

本研究以欧洲癌症研究和治疗组织/侵袭性真菌感染协作组和美国国立变态反应和感染病研究院真菌病研究组（EORTC/MSG）共识组于2008年修订并发表的IFD定义的国际共识为诊断标准[1-2]，将诊断结果分为：确诊、拟诊和疑似。本研究采用回顾性研究方法，查阅病史，综合分析患者临床症状和体征、影像学及微生物学检测结果、药物使用情况及疗效，作出相应诊断结果。诊断结果以确诊或拟诊IFD为真阳性，非IFD为真阴性。

1.3 研究方法

1.3.1 G试验采用IGL 800全自动真菌/细菌动态检测仪和天津喜诺生物有限公司（GC180424）真菌G试验试剂盒，进行动态光度法检测。

1.3.2 真菌学检查包括真菌涂片和真菌培养及鉴定。标本为合格痰、支气管肺泡灌洗液、血、脑脊液、腹水和组织置换液。痰真菌培养阳性病例需同时符合真菌涂片阳性方纳入统计。采用科玛嘉沙保弱葡萄糖琼脂培养基、科玛嘉念珠菌显色培养基、API20C AUX及ID32C或基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术（MALDI-TOF MS）（江苏天瑞仪器公司）进行分离、鉴定。

1.3.3 隐球菌荚膜抗原检测采用美国Immuno-Mycologics公司生产的隐球菌荚膜抗原试剂盒，对样本进行隐球菌荚膜抗原定量和定性检测。

1.4 统计分析

检测结果以确诊或拟诊IFD为真阳性，非IFD为真阴性。采用SPSS 17.0软件，组间计量资料比较用χ2检验，以P＜0.05为差异具有统计学意义，进行统计学分析。计算单项检测方法和联合检测的灵敏度、特异度、阳性预测值和阴性预测值。

2 结果

2.1 病例分布

选取在2018年2－12月我院上述8个科室住院期间同时进行G试验、真菌涂片和真菌培养的患者共942例，其中184例另行隐球菌荚膜抗原检测。按病原菌进行区分：侵袭性念珠菌病确诊62例，疑似127例；侵袭性曲霉病确诊11例，拟诊33例，疑似27例；侵袭性隐球菌病确诊35例；地方性真菌病确诊7例，其中确诊马尔尼菲篮状菌病5 例，荚膜组织胞浆菌病和着色真菌病各1例。非感染640例。

2.2 G试验检测结果

G试验结果以100 ng/L为阳性临界值。以确诊或拟诊IFD为真阳性（隐球菌除外），非IFD诊断为真阴性。942例患者中，除去疑似IFD 154例及确诊侵袭性隐球菌病35例，余下753例中，G试验阳性334，阴性419例。G试验与临床诊断比较见表 1。四格表分析，G试验灵敏度为92.9%，特异度为59.0%；阳性预测值和阴性预测值分别为31.4%和98.1%。见表2。

2.3 涂片、培养等真菌学检测结果

在上述的753例中，真菌涂片阳性87例，阴性666例；真菌培养阳性133例，其中真阳性88例。真菌学检查与临床诊断比较见表1，真菌学检查灵敏度、特异度、阳性预测值及阴性预测值见表2，真菌培养结果及相应G试验阳性结果见表3。

2.4 联合检测结果

将G试验、真菌涂片及真菌培养三项试验联合进行检测，三项中至少有两项结果阳性则为联合检测阳性，余为联合检测阴性。联合检测结果与临床诊断的比较见表1，联合检测灵敏度、特异度、阳性预测值及阴性预测值见表2。

表1 G 试验和真菌学检查及联合检测结果Table 1 Results of G-test，mycological examinations and combined panel test

表2不同检测方法用于诊断IFD时灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值比较Table 2 Sensitivity，specifcity，positive predictive value and negative predictive value compared between different laboratory assays in diagnosis of invasive fungal diseases（%）

表3真菌培养真阳性菌种分布情况及相应G 试验阳性株数Table 3 Distribution of fungal species by specimen type and the corresponding positive number detected by G-test

2.5 G试验与隐球菌荚膜抗原检测

在184例进行隐球菌荚膜抗原检测标本中，35例确诊隐球菌病，隐球菌荚膜抗原检测均为阳性（定量滴度从1∶10～1∶1 256）；其余诊断为非IFD，隐球菌荚膜抗原检测均为阴性。35例隐球菌病中，G试验阳性27例；149例非隐球菌病中，G试验阴性121例。G试验对隐球菌病灵敏度为77.1%，特异度为81.2%；阳性预测值为49.1%，阴性预测值为93.8%。

3 讨论

随着广谱抗生素、免疫抑制剂和各种导管插管等治疗手段应用及造血干细胞和实体器官移植的开展，自身免疫性疾病、艾滋病、恶性肿瘤及糖尿病等基础疾病发病率的增加以及人口老龄化等因素，IFD发病率和死亡率逐年升高。同时，近年来发现IFD不仅在免疫缺陷患者中常见，在免疫正常患者如慢性阻塞性肺疾病患者中发病率也出现上升[3]。

（1，3）-β-D葡聚糖是一种广泛存在于真菌细胞壁中的多糖成分（接合菌和隐球菌除外）[4]，可通过特异性激活鲎变形细胞裂解物中的G因子，激发凝血级联反应，形成凝固蛋白后利用比色法或比浊法进行定量检测，故命名为G试验[5]。侵袭性真菌感染时真菌被吞噬处理后，持续释放（1，3）-β-D葡聚糖，此时检测血液或体液中（1，3）-β-D葡聚糖抗原含量会显著增高[6]。浅部真菌感染或定植时，（1，3）-β-D葡聚糖未被释放，故其血清检测为阴性。研究提示（1，3）-β-D葡聚糖对侵袭性真菌感染诊断有重要价值[7]，并且凭其方便快捷、耗时短的优势，在深部真菌感染早期诊断中起着重要作 用。

本研究结果显示，对于除隐球菌感染外的其他IFD，G试验灵敏度为92.9%，显著高于直接涂片和真菌培养；特异度为59.0%，明显低于真菌学检测方法；G试验阳性预测值为31.4%，阴性预测值较好，为98.1%。以上数据均与文献报道一致[8]。G试验阳性预测值较差，存在假阳性的因素常见于使用葡聚糖的静脉制剂或纱布等医用材料，使用纤维素膜进行透析，服用多糖类抗肿瘤药物、菌菇类食物或输注免疫球蛋白等血液制品，链球菌菌血症，标本脂血，黄疸及污染等[9-10]。G试验阳性结果对于IFD虽然不具特异性，但能够提示侵袭性真菌感染的可能性。而造成G试验假阴性可能与以下原因有关：①患者存在吞噬细胞功能缺陷，如粒细胞缺乏症等，真菌进入血液但是没有被吞噬细胞处理，（1，3）-β-D葡聚糖未被释放出来或释放很少；②血液中（1，3）-β-D葡聚糖被免疫系统清除或自然降解；③（1，3）-β-D葡聚糖可能与相应抗体形成免疫复合物，而不能被检出；④标本室温放置时间过长或冻存后标本中（1，3）-β-D葡聚糖自然降解；⑤临床上为了减少IFD发病率，在诊断之初预防性使用某些抗真菌药物，抑制（1，3）-β-D葡聚糖释放；⑥局灶性曲霉病及近平滑念珠菌引起的侵袭性感染G试验灵敏度较低或呈阴性结果。本研究中，真菌直接涂片法特异度较高，且直接涂片法可为临床提供最为直接的诊断依据，具有检测快速的优势，但其灵敏度较低，标本质量及检验人员的技术水平直接影响检验结果。而真菌培养作为诊断深部真菌感染的重要方法，能对培养出的真菌进行鉴定和药敏试验，为临床合理使用抗真菌药物提供有效证据，但培养周期较长，具有滞后性[11]，阳性预测值也较低，亦无法满足临床需求。

早期诊断对于侵袭性真菌感染治疗成败起着重要作用。将G试验、真菌涂片镜检与真菌培养联合检测一定程度上弥补了单独检测的各自不足。本实验中，联合检测诊断IFD灵敏度可达97.3%；阴性预测值达99.5%，即当三种检测方法检验结果均为阴性时，提示患者感染IFD的可能性非常小，有助于排除IFD诊断，降低漏诊率和误诊率。联合检测的特异度及阳性预测值较单独G试验对应指标也有很大提高，对于指导临床尽早抗真菌治疗更有说服力。因此，临床上将三种方法联合使用，既可具有G试验简便、快速、灵敏度高的优点，又具有直接涂片法及真菌培养法能区分真菌种属的优势，为临床提供直接诊断依据。

对于隐球菌病检测常采用隐球菌荚膜抗原检测，该法简便、快速，能有效诊断隐球菌感染，且具有良好的灵敏度和特异度，虽然本试验中隐球菌荚膜抗原检测灵敏度和特异度均达到100%，但在临床使用中不可避免存在假阳性和假阴性。一方面，系统性红斑狼疮、结节病、类风湿因子、抗酸杆菌均与新型隐球菌荚膜多糖抗原存在交叉抗原，引起假阳性；另一方面，高水平隐球菌抗原所致的钩带现象和体内未知非特异性蛋白对隐球菌抗原的掩盖效应，可引起假阴性[12]。传统观点认为隐球菌细胞壁外荚膜致使（1，3）-β-D葡聚糖难以释放，因此G试验通常不适用于隐球菌检测。但根据本研究结果，G试验诊断隐球菌感染灵敏度达到77.1%，说明部分隐球菌感染患者血清（1，3）-β-D葡聚糖也有升高并能被G试验检测出；同时本试验中G试验对隐球菌病阴性预测值较好，这与以往结论出现偏差，一方面可能为本实验标本数量采集有限所致，另一方面隐球菌感染可能与（1，3）-β-D葡聚糖释放仍存在一定联系。

综上所述，G试验虽然无创快捷，有助于临床早期快速判断，但结果受干扰因素较多，影响其特异度及阳性预测值；真菌涂片方便简单，但阳性检出率取决于标本的采集与质量，以及检验人员的技术水平；真菌培养可以确定感染的菌种，有助于抗真菌药物的选择，合格标本培养阳性具有重要意义。隐球菌荚膜抗原检测虽然灵敏度、特异度均良好，但仍会存在少量假阳性的弊端。临床将G试验与真菌学检测方法联合使用，扬长避短，能为临床及时准确诊断提供有力支撑，提高患者治愈率和生存率。