王 伟， 王 斌， 于 亮， 王伟伟， 曹平平， 陆 莉， 王奉芝， 钮力亚

(1.河北省农作物耐盐碱评价与遗传改良重点实验室/沧州市农林科学院， 河北 沧州 061001；2.东平县老湖镇农业生产综合服务队， 山东 泰安 271511)

小麦在全球的种植面积广泛，在我国农业生产中占有重要地位。诱变育种是小麦新品种选育和种质资源创新的重要手段。化学诱变是小麦遗传改良的重要途径之一[1]。叠氮化钠(NaN3)是一种高效低毒的植物化学诱变剂，其已在小麦[2-3]、玉米[4]、水稻[5]、大麦[6-7]，大豆[8]等农作物上得以应用。另外，张希太等[9-11]研究了小麦叠氮化钠诱变后代在株高、芒型、穗型等的变异特征，并从分子水平证明了叠氮化钠对小麦的诱变效果。但鲜有应用叠氮化钠构建小麦突变体库方面的研究报道。

在小麦育种中对目标性状的选择，常规育种手段易受环境条件和育种者主观经验的影响，而且育种周期长、效率低，但其操作方法简单、性状选择全面，目前仍是小麦育成品种的主要方法[12]。近年来，随着高通量测序技术的发展，基于小麦基因组开发的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)和插入缺失(insertion-deletion，InDels)等标记被广泛用于遗传图谱的构建、基因的精细定位、关联分析等研究[13-14]。由LGC公司(Laboratory of the Government Chemist)研发的竞争性等位基因特异性PCR技术(Kompetitive Allele Specific PCR，KASP)是一项灵活、经济、准确的SNP检测方法，逐渐替代了传统的高通量测序，在SNP分型研究中发挥重要作用[15]。KASP标记有利于筛选出控制小麦有利性状的基因，并指导后续品种改良以及进行基因验证。沧麦6005是沧州市农林科学院育成的1个抗旱耐盐碱的囯审小麦品种，在前期的研究中已培养出73个叠氮化钠诱变的突变家系，但是仍然不清楚这些品系重要性状功能基因的遗传组成。本研究旨在利用已发表的小麦重要农艺性状功能基因的KASP标记，对73份沧麦6005叠氮化钠诱变家系进行单倍型检测，了解这些品系重要性状功能基因的组成，可以在一定程度上了解该群体的遗传特性，为探讨提高小麦分子标记辅助育种效率的策略，准确评价育种材料的利用价值提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料为沧麦6005及其叠氮化钠诱变群体，共74个。2017年10月，种于沧州市农林科学院前营试验站。随机区组试验设计，2次重复。田间正常管理，2018年6月收获。

1.2 试验方法

注：红色表示HEX基因型；蓝色表示FAM基因型；黑色点为空白对照。A为Rht-B1基因的KASP标记Rht-B1_SNP；B为TaMFT-A1基因的KASP标记TaMFT_721J；C为Dreb-B1基因的KASP标记Dreb_SNP；D为TaMFT-A1基因的KASP标记TaMFT_1617R。图1 KASP标记的散点聚类图

在小麦返青期，进行田间取样。将叶片放入加有钢珠的2.0 mL的Eppendorf管中，每个材料进行2次重复。将样品液氮速冻后，在研磨机上研磨成粉状。利用植物基因组DNA提取试剂盒进行DNA提取。利用Nanodrop One超微量分子分光光度计进行DNA质量检测，标准为OD260/OD280值介于1.8～2.2，OD260/OD230值大于1.0。对质检合格的样本进行DNA稀释，浓度范围为5～50 ng。

根据文献[16]，由中玉金标记生物技术股份有限公司合成株高、抗叶锈病、抗赤霉病、抗穗发芽和品质相关基因等的KASP标记引物(表3)。FAM-primer 5′末端连接1个荧光基团FAM (5′-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-3′)，HEX-primer 5′末端连接1个荧光基团HEX (5′-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3′)。利用KASP 5000 V 4.0 2×MasterMix (LGC公司，英国)进行PCR扩增。PCR反应体系为10μL，包括4.78μL DNA (5～50 ng·μL-1)，5μL KASP 5000 V 4.0 2×MasterMix，0.14μL KASP Assay Mix，0.08μL Mg+。KASP Assay Mix是由3条引物的稀释获得：先将引物稀释成100μmol·L-1，再按FAM-primer∶HEX-primer∶Common primer∶ddH2O=12∶12∶30∶46的比例混合。PCR反应在Bio-Rad CFX 96 PCR仪上进行。每次反应设置4个空白对照组(NTC)。PCR反应为降落PCR，反应程序为：94 ℃热处理15 min；94 ℃ 20 s, 61～55 ℃ 60 s (每个循环下降0.6 ℃)，10个循环；94 ℃ 20 s，55 ℃ 60 s，26个循环；4 ℃避光保存。待KASP检测PCR反应程序结束后，将384孔板或Tape分别放置到Omega荧光信号阅读仪和Araya上将荧光信号转变为可分析的数值，然后用LGC公司提供的Kraken TM分析软件进行基因型分析。

2 结果与分析

利用KASP标记检测技术对沧麦6005及其叠氮化钠诱变群体的株高、抗叶锈病、抗赤霉病、抗穗发芽和加工品质等性状相关的基因进行了分析。部分聚类结果见图1。在该群体中，此4个基因的分布均聚合为两类，表示2种不同的纯合单倍型，而且界限清楚、明确。综合结果表明，利用KASP标记检测技术可以有效地对上述基因进行分型，并将同一基因的不同单倍型进行聚类。另外，本试验所用小麦材料主要是沧麦6005叠氮化钠诱变的高代品系，因此，相关研究结果一定程度上可以从分子水平验证叠氮化钠对沧麦6005的化学诱变效果。

2.1 株高基因

73份叠氮化钠诱变家系中有6种株高基因型组合，分别是Rht-B1a+197bp+Rht-D1a(1份)、Rht-B1a+197bp+Rht-D1b(39份)、Rht-B1a+Rht-D1a(1份)、Rht-B1a+Rht-D1b(13份)、Rht-B1b+Rht-D1a(13份)和Rht-B1b+Rht-D1b(3份)，含有Rht-D1b的家系占全部突变家系的75.34%(表1)。沧麦6005的株高基因型为Rht-B1b+Rht-D1a(表2)。说明在该群体中Rht-D1b基因可能是由于叠氮化钠诱变而产生的矮秆基因。

2.2 抗病基因

共检测了3个抗病基因，包括抗叶锈病基因(Lr34和Lr68)和抗赤霉病基因Fhb1。结果显示，抗叶锈病基因Lr68在此诱变群体中有7份，占群体的9.60%；该群体不含有抗叶锈病基因Lr34；抗赤霉病基因Fhb1在此诱变群体中检测到5份，占比6.80%(表1)。沧麦6005的KASP标记检测结果表明，野生型沧麦6005不含有抗叶锈病基因Lr34和Lr68，亦不含有抗赤霉病基因Fhb1(表2)，而在其叠氮化钠诱变群体中，出现了抗叶锈病基因Lr68和抗赤霉病基因Fhb1的类型，这是由于叠氮化钠诱变的结果。说明在小麦诱变育种中通过叠氮化钠诱变方法，可以获得具有抗叶锈病基因和抗赤霉病基因的材料。

表1 沧麦6005叠氮化钠诱变群体重要性状基因的KASP标记检测

性状基因单倍型数目频率/%株高Rht-B1Rht-B1a+197bp+Rht-D1a11.4Rht-D1Rht-B1a+197bp+Rht-D1b3955.7Rht-B1a+Rht-D1a11.4Rht-B1a+Rht-D1b1318.6Rht-B1b+Rht-D1a1318.6Rht-B1b+Rht-D1b34.3叶锈病Lr34Lr34+00.0Lr34-73100.0Lr68Lr68+79.6Lr68-6690.4赤霉病Fhb1Fhb1+56.8Fhb1-6589.0春化Vrn-A1vrn-A173100.0Vrn-A100.0Vrn-A1bVrn-A1b73100.0Vrn-A1a00.0Vrn-B1Null73100.0Vrn-B1b00.0穗发芽TaSdr-B1TaSdr-B1a34.1TaSdr-B1b6893.2PHS1Rio Blanco type5375.3NW97S186 type1824.7TaMoc-A1Hap-H1621.9Hap-L5372.6TaMFT-A1Jagger-type1520.5Zen/2174-type2230.1CS-type3547.9品质Glu-D12 + 12 or other2027.45 + 104561.6Glu-A1Ax1 or Ax2*1824.7Null5575.3抗旱性COMT-3B3Ba5575.33Bb1520.5Dreb-B1TaDREB-B1a2838.4TaDREB-B1b4460.3TaSST-4AA2a5271.2A2b2027.4早熟性TaELF3-B1Cadenza-type73100.0Wild-type00.0TaElf3-D1Savanah-type00.0Wild-type3649.3

注：Rht-B1a和Rht-D1a是野生型，Rht-B1b、Rht-B1a + 160和Rht-D1b是矮杆型；Jagger-type、Zen/2174-type、Hap-H、TaSdr-B1a和RioBlancotype为抗穗发芽类型，CS-type、Hap-L、TaSdr-B1b和NW97S4186type为易穗发芽类型；vrn-A1、Vrn-A1b、Null为冬性小麦类型；5+10和Ax1orAx2*为强筋型，2+12orother和Null为弱筋型；3Ba、TaDREB-B1a和A2a是抗旱类型，3Bb、TaDREB-B1b和A2b是不抗旱类型；对于TaELF3-B11，Cadenza-type为晚开花类型，Wild-type为早开花类型，对于TaElf3-D1，Savanah-type为早开花类型，Wild-type为晚开花类型；+和-分别表示含有或不含有该基因。下同。

2.3 春化基因

共检测了3个春化基因，包括Vrn-A1、Vrn-A1b和Vrn-B1。在春化基因Vrn-A1、Vrn-A1b和Vrn-B1中，所有的突变材料的单倍型分别为vrn-A1、Vrn-A1b和Null，均为冬性(表1)，这与野生型沧麦6005的KASP检测结果一致(表2)。同时，沧麦6005及其诱变家系田间表现均为冬性小麦。

2.4 抗穗发芽基因

在抗穗发芽基因方面，共检测了4个抗穗发芽的基因，分别为TaSdr-B1、PHS1、TaMoc-A1和TaMFT-A1。RioBlancotype和Hap-H是诱变家系中主要的抗穗发芽单倍型。有3份材料含TaSdr-B1基因的TaSdr-B1a抗穗发芽单倍型，占全部诱变材料的4.1%；有53份材料含有PHS1基因的RioBlancotype抗穗发芽单倍型，占全部供试材料的75.3%；有16份材料含有TaMoc-A1基因的Hap-H抗穗发芽单倍型，占全部供试材料的21.9%；在所有供试材料中含TaMFT-A1基因的Jagger-type和Zen/2174-type抗穗发芽单倍型的材料数分别为15份和22份，分别占全部供试材料的20.5%和30.1%(表1)。另外，在所有诱变家系中没有出现同时聚合4个抗穗发芽单倍型的材料，但是同时聚合2个抗穗发芽单倍型的不少，比如SAM 46同时聚合TaSdr-B1基因的TaSdr-B1a抗穗发芽单倍型和TaMoc-A1基因的Hap-H抗穗发芽单倍型。这表明在常规手段进行综合农艺性状选择的基础上，采用叠氮化钠进行小麦育种，利用KASP标记也可以选择到具有多个优良基因的后代材料。

2.5 品质相关基因

共检测了2个品质相关基因Glu-D1和Glu-A1。有45份材料含有高分子量麦谷蛋白亚基5+10，占全部供试材料的61.6%；有18份材料含有Glu-A1基因的Ax1orAx2*强筋单倍型，占全部供试材料的24.7%(表1)。但是，没有出现同时聚合这2种强筋单倍型的诱变材料。

2.6 抗旱相关基因

共检测了3个与小麦抗旱性相关的基因，分别为COMT-3B、Dreb-B1和TaSST-4A。有55份材料含有COMT-3B基因的3Ba单倍型，占全部供试材料的75.3%；有28份材料含有Dreb-B1基因的TaDREB-B1a抗旱单倍型，占全部供试材料的38.4%；有52份材料含有TaSST-4A基因的A2a抗旱单倍型，占全部供试材料的71.2%(表1)。其中，COMT-3B基因可增加茎秆木质素含量，可能与抗倒性相关。

表2 沧麦6005及其部分叠氮化钠诱变群体KASP标记的基因分型

基因品系沧麦6005SAM8SAM27SAM30SAM33SAM36SAM42SAM43SAM44SAM56SAM57SAM58Rht-B1Rht-B1bRht-B1aRht-B1aRht-B1bRht-B1bRht-B1a+197 bpRht-B1a+197 bpRht-B1a+197 bpRht-B1a+197bpRht-B1bRht-B1bRht-B1bRht-D1Rht-D1aRht-D1bRht-D1aRht-D1aRht-D1aRht-D1bRht-D1bRht-D1bRht-D1bRht-D1aRht-D1aRht-D1aLr34------------Lr68-+----------Fhb1--+--+++----Glu-D12+12or other2+12or other2+12or other2+12or other2+12or other5+105+105+105+102+12or other2+12or other2+12or otherGlu-A1Ax1 or Ax2*Ax1 or Ax2*NullAx1 or Ax2*Ax1 or Ax2*NullNullNullNullAx1 or Ax2*Ax1 or Ax2*Ax1 or Ax2*Vrn-A1vrn-A1vrn-A1vrn-A1vrn-A1vrn-A1vrn-A1vrn-A1vrn-A1vrn-A1vrn-A1vrn-A1vrn-A1Vrn-A1bVrn-A1bVrn-A1bVrn-A1bVrn-A1bVrn-A1bVrn-A1bVrn-A1bVrn-A1bVrn-A1bVrn-A1bVrn-A1bVrn-A1bVrn-B1NullNullNullNullNullNullNullNullNullNullNullNullTaSdr-B1TaSdr-B1bTaSdr-B1bTaSdr-B1bTaSdr-B1bTaSdr-B1bTaSdr-B1bTaSdr-B1bTaSdr-B1bTaSdr-B1bTaSdr-B1bTaSdr-B1bTaSdr-B1bPHS1Rio Blanco typeRio Blanco typeRio Blanco typeRio Blanco typeRio Blanco typeNW97S186 typeNW97S186 typeNW97S186 typeNW97S186 typeRio Blanco typeRio Blanco typeRio Blanco typeTaMoc-A1Hap-LHap-LHap-LHap-LHap-LHap-LHap-LHap-LHap-LHap-LHap-LHap-LTaMFT-A1CS-typeJagger-typeCS-typeCS-typeCS-typeCS-typeCS-typeJagger-typeCS-typeJagger-typeZen/2174-typeZen/2174-typeTaELF3-B1Cadenza-typeCadenza-typeCadenza-typeCadenza-typeCadenza-typeCadenza-typeCadenza-typeCadenza-typeCadenza-typeCadenza-typeCadenza-typeCadenza-type3/TaElf3-D1Wild-typeWild-typeWild-typeWild-typeWild-typeWild-typeWild-typeWild-typeWild-typeWild-typeWild-typeWild-typeCOMT-3B3Ba3Ba3Ba3Ba3Ba3Ba3Ba3Ba3Bb3Bb3Bb3BbDreb-B1TaDREB-B1bTaDREB-B1aTaDREB-B1aTaDREB-B1bTaDREB-B1bTaDREB-B1aTaDREB-B1aTaDREB-B1aTaDREB-B1aTaDREB-B1aTaDREB-B1aTaDREB-B1aTaSST-4AA2bA2aA2aA2bA2bA2bA2bA2bA2aA2aA2aA2a

表3 本试验部分KASP标记

性状基因引物名称FAM primer(5'-3')HEX primer(5'-3')Common primer(5'-3')株高Rht-B1Rht-B1_SNPGAAGGTGACCAAGTTCATGCTCCCATGGCCATCTCCAGCTGGAAGGTCGGAGTCAACGGATTCCCATGGCCATCTCCAGCTATCGGGTACAAGGTGCGGGCGRht-D1Rht-D1_SNPGAAGGTGACCAAGTTCATGCTCATGGCCATCTCGAGCTGCTCGAAGGTCGGAGTCAACGGATTCATGGCCATCTCGAGCTGCTACGGGTACAAGGTGCGCGCC叶锈病Lr34Lr34_TCCINDGAAGGTGACCAAGTTCATGCTGGTATGCCATTTAACATAATCATGAAGAAGGTCGGAGTCAACGGATTGGTATGCCATTTAACATAATCATGATTACTATATGGGAGCAT-TATTTTTTTCCLr68Lr68-2GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCGTGTCTTGGACCTGAGCAATGAAGGTCGGAGTCAACGGATTCGTGTCTTGGACCTGAGCAACTGACCTGAGTCCCGTCAAGA赤霉病Fhb1UMN10_SNPGAAGGTGACCAAGTTCATGCTGAAT-TACTCATTTTTAGATTTGTCTACATACAGAAGGTCGGAGTCAACGGATTGAATTACTCATTTTTAGATTTGTCTACATACGGAAGTTCATGCCACGCATATGCTAGTA品质Glu-D1Glu-D1d_SNPGAAGGTGACCAAGTTCATGCTATAGTATGAAACCTGCTGCGGAGGAAGGTCGGAGTCAACGGATTATAGTATGAAACCTGCTGCGGACTACTAAAAAGGTATTACCCAAGTGTAACTT穗发芽TaSdr-B1TaSdr-B1GAAGGTGACCAAGTTCATGCTTCAGCAGACTTCGACTCGCAGAAGGTCGGAGTCAACGGATTTCAGCAGACTTCGACTCGCGAGGATCTCGTTGGCCTTGACGPHS1PHS1-666GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGTGAGTGTTATATGAAACTAATGATCCATTTGAAGGTCGGAGTCAACGGATTGTGAGTGTTATATGAAACTAATGATCCATTAACCGGGTGGAACAGATGCAACTA-AA早熟性TaElf3-D1TaBradi2g14790GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCCTTGTCTCCGTCCCTGGAAGGTCGGAGTCAACGGATTGACAGCTCCTCCCGAGTCGGTAATGTCTTCAGTGTTTTA春化Vrn-A1Vrn-A1_9K0001GAAGGTGACCAAGTTCATGCTAGAGTTTTCCAAAAAGATAGATCAATG-TAAATGAAGGTCGGAGTCAACGGATT-GAGTTTTCCAAAAAGATAGATCAAT-GTAAACGTTAGTAGTGATGGTCCAATAATGCCAAA抗旱性COMT-3BCOMT3B_882_SNPGAAGGTGACCAAGTTCATGCTGTGCTCGTGGAGTGCATCCTGCCTGAAGGTCGGAGTCAACGGATTGTGCTCGTGGAGTGCATCCTGCCGCCTTAGGCGTCGCCTCCGGGTTCA

2.7 早熟性相关基因

共检测了2个小麦早熟性相关基因，分别为TaELF3-B1和TaElf3-D1。所有的供试材料为TaELF3-B1基因的晚开花单倍型Cadenza-type；有36份材料含有TaElf3-D1的晚开花单倍型Wild-type，另外36个材料在该位点杂合(表1)。

综上所述，在野生型沧麦6005基因型没有的情况下，73份诱变后代中发现含抗赤霉病基因Fhb1的材料5份，含抗叶锈病基因Lr68的材料7份，含5+10优质亚基45份，含Rht-D1b矮杆基因55份。因此，对小麦叠氮化钠诱变高代品系进行KASP标记辅助选择可作为一种重要的分子育种策略。

3 讨 论

小麦诱变育种是利用物理、化学等因素，在人为创造的条件下，诱发小麦种子或植株产生基因突变，进而培育新种质的方法[17-18]。在农作物改良中，化学诱变是产生变异性状的重要来源之一，是目前应用较为广泛的诱变育种技术[19]。叠氮化钠是一种高效且无毒害作用的植物化学诱变剂，可使小麦突变材料的变异类型更加丰富。本研究表明，叠氮化钠诱变可使沧麦6005产生矮秆基因、抗病基因以及优质基因等突变，这与Khan S等[20]，李明飞等[21]研究结果基本一致。利用叠氮化钠进行化学诱变的方法是创造小麦新种质、选育小麦新品种的有效途径之一。

小麦是当今世界重要的粮食作物之一，矮秆基因是小麦高产育种的关键因素。在推广小麦品种中应用的Rht基因主要是Rht-B1、Rht-D1、Rht8[22-24]。Rht-B1和Rht-D1都是来自于日本的农林10号[25]。在本研究中，Rht-D1b在供试材料中的分布频率大于Rht-B1b，含有Rht-D1b的家系占全部突变家系的75.34%。而沧麦6005的株高基因型为Rht-B1b+Rht-D1a，说明在该群体中Rht-D1b基因可能是由于叠氮化钠诱变而产生的。

截止2015年，正式登记命名的小麦叶锈抗性基因有73个[26]，其中Lr34为苗期抗性基因，但是在此叠氮化钠诱变群体中未检测到抗叶锈病基因Lr34。Lr68为成株抗性基因[27]，此叠氮化钠诱变群体中检测到含抗叶锈病基因Lr68的材料7份。目前已明确的小麦抗赤霉病基因只有7个，其中就包括Fhb1，Fhb1来源于苏麦3号，抗性最为稳定[28]。此诱变群体检测到含抗赤霉病基因Fhb1的材料5份。另外，KASP标记检测结果显示，野生型沧麦6005不含有抗叶锈病基因Lr68和抗赤霉病基因Fhb1，而诱变群体出现了相应的抗病材料，这肯定是叠氮化钠诱变的结果。因此，叠氮化钠诱变方法和KASP标记辅助选择结合起来，可以作为一种分子辅助育种的策略。

穗发芽对小麦的产量和品质等方面均有影响，小麦穗发芽抗性易受基因型与环境因素的共同影响，其中籽粒本身的休眠特性和α-淀粉酶活性也与穗发芽联系紧密[29-30]。本研究分析了4个抗穗发芽基因TaMFT-A1、PHS1、TaMoc-A1、TaSdr-B1在沧麦6005叠氮化钠诱变群体中的分布情况。其中，有53份材料含有PHS1基因的RioBlancotype抗穗发芽单倍型，其他3个基因的抗穗发芽单倍型亦均有分布。目前已知的抗穗发芽相关基因的遗传效应均很弱，聚合多个抗穗发芽基因，有利于拓宽抗谱，提高小麦的抗性[31-32]。因此，多基因聚合育种是小麦抗穗发芽育种的主要策略。

小麦优质谷蛋白亚基5+10被认为是Glu-D1位点编码的优质亚基，有利于制作面包[33-34]。在本研究中，有45份材料含有高分子量麦谷蛋白亚基5+10，有18份材料含有Glu-A1基因的Ax1orAx2*，它们可作为强筋小麦品系的候选材料。

随着小麦以及相关近缘种属基因组测序的完成，以及各种基因检测技术的发展，分子标记辅助选择已经成为小麦育种的重要手段之一。通过分子标记检测可以在小麦育种的过程中有效地选择目的基因，减少育种中的筛选与鉴定的工作量，提高目的基因选择的准确度，并为加速小麦育种进程奠定了基础。因此，对小麦叠氮化钠诱变的高代品系进行KASP标记辅助选择可作为一种重要的分子育种策略。