MUGISHA Samson， 杨套伟， 徐美娟， 张 显， ULIHO Alphonse，钱海峰， 王 立， 饶志明*

（1. 江南大学 生物工程学院， 江苏 无锡214122；2. 江南大学 工业生物技术教育部重点实验室， 江苏 无锡214122；3. 江南大学 食品学院，江苏 无锡214122）

过氧化氢酶（过氧化氢氧化还原酶，EC1.11.1.6）广泛存在于好氧生物中，在动植物、细菌、真菌、古生菌中。它通过歧化作用直接分解由活性氧ROS 产生的过氧化氢形成水和氧气。其中，ROS 是由细胞正常生长过程中线粒体电子传递所形成的。 然而，过多的ROS 和自由基会导致细胞氧化性损伤甚至死亡[1-3]。因此，在氧化还原不平衡时，过氧化氢酶通过催化过氧化氢分解起到了解毒作用[4]。 此外，过氧化氢酶广泛应用于食品加工、纺织和临床检测中[5-7]。

根据其功能特点， 过氧化氢酶被分为3 类: 含血红素过氧化氢酶、 过氧化氢-过氧化物双功能酶以及含锰离子的过氧化氢酶[8-9]。 其中单功能的过氧化氢酶由于其商业价值而受到更多的关注。 目前，许多研究者致力于筛选不同微生物来源的过氧化氢酶，并进行同源或异源表达，以适用于不同的用途[10-13]。蛋白质工程策略已被广泛应用于提高靶蛋白的性能，其中基于结构模拟和计算等理性设计的定点突变来改造蛋白的方法已被广泛使用[14-18]。 研究报道了不同种类的酶通过定点突变成功的提高了其催化能力及热稳定性[18-19]，但是对过氧化氢酶进行热稳定性改造的报道却较少[20-21]。

短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）由于具有多种抗氧化酶，从而比其他微生物具有更好的抗氧化能力[22-23]。本研究中, 选择B. pumilusML413 来源的过氧化氢酶作为研究对象。 另外，菌株枯草芽孢杆菌168 由于具有良好的分泌表达能力而被广泛作为工业表达宿主[24-25]，同时也被用来作为过氧化氢酶的异源表达的宿主菌。 本研究采用枯草芽孢杆菌168作为过氧化氢酶表达宿主菌， 利用 PoPMuSiC algorithm 软件计算并预测了B. pumilusML413 血红素过氧化氢酶(KatX2)的活性中心潜在突变位点的折叠自由能，对该位点附近的氨基酸进行一系列定点突变来提高该区域的疏水性，从而提高过氧化氢酶的热稳定性。

1材料与方法

1.1 菌株，质粒和材料

B. pumilusML413 为本研究室保藏。E. coliJM109 和B. subtilis168 分别作为克隆和表达菌株。质粒pMA5 和pMD18-T 分别作为表达和克隆载体。 PrimeSTARe 扩增酶、ExTaq DNA 扩增酶、T4 DNA 连接酶、限制性内切酶BamHI 和MluI，购自宝生物（大连）有限公司；DNA 提取试剂盒、质粒提取试剂盒、DNA 回收试剂盒，购自生工生物工程（上海）有限公司；HisTrapTMHP 纯化柱，购自美国通用医疗集团；其他试剂均为商业化商品。

1.2 定点突变及重组菌株的构建

以B. pumilusML 413 的DNA 为模板， 用引物KatX2 F 和KatX2 R（表1）进行PCR 扩增得到过氧化氢酶基因。 扩增产物经纯化后与克隆载体pMD18-T 连接获得重组质粒pMD18T-KatX2.用BamHI 和MluI 对pMD18T-KatX2 和pMA5 分别进行双酶切， 纯化后， 将得到的KatX2 和线性化的pMA5 进行连接获得重组质粒pMA5-KatX2, 随后将该重组质粒利用Spizizen 描述的方法转化到枯草芽孢杆菌168 中[26]。 以重组质粒pMA5-KatX2 为模板，用表1 所示的引物进行重叠延生PCR 的方法进行定点突变[27]。 含突变基因的质粒转入到大肠杆菌JM109 中并验证，并送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序，测序正确的重组质粒转入到枯草芽孢杆菌168 中进行表达， 以菌株B.subtilis168/pMA5-KatX2 作为对照。

表1 引物序列表Table 1 Nucleotide sequences of primers

1.3 培养条件

挑取单菌落于10 mL 含50 mg/L 卡那霉素的LB 培养基，37 ℃，180 r/min 过夜培养后， 以10%的接种体积分数接种于含50 mg/L 卡那霉素的发酵培养基(甘油47 g/L, NH4Cl 1.5 g/L, 玉米浆15 g/L，K2HPO42.7 g/L，KH2PO42.1 g/L，MgSO4·7H201.9 g/L，NaCl 5 g/L， 酵母粉35 g/L，FeSO4·7H2O 0.0025 g/L，pH 7.0)中培养54 h。 在4 ℃下，10000 g 离心20 min，离心后收集上清液，并用0.22 mm 滤膜过滤后备用。

1.4 过氧化氢酶的纯化

为防止酶的降解，纯化在4 ℃条件下进行。 首先，用终体积分数为60%的乙醇沉淀发酵液中的蛋白质，10000 g 离心30 min 收集蛋白质沉淀。接着，用磷酸钾缓冲液（20 mmol/L，pH 7.0）悬浮，并用该缓冲液透析12 h 以除去多余离子。最后，将收集的样品用Ni2+亲和色谱层析的方法，利用AKTA 蛋白纯化仪（GE Healthcare，USA）进行纯化，流速0.5 mL/min，用binding buffer（0.02 mol/L Tris-HCl buffer, 0.5 mol/L NaCl, pH 7.4）将粗酶液吸附至1mL HisTrapTMHP 纯化柱上，并用0～0.5 mol/L 的咪唑梯度洗脱得到过氧化氢酶纯酶。 用Bradford 法测定蛋白质浓度[28]. 用SDS-PAGE 对蛋白质的表达及纯化情况进行分析。

1.5 酶活测定

过氧化氢酶的酶活测定在37 ℃下进行。 将100 μL 的酶溶液加入到3 mL 反应液（50 mmol/L 磷酸钾缓冲液（pH 7.0），10 mmol/L H2O2）中，在240 nm测定60 s 内吸光度的变化[29]。 酶活单位：在37 ℃下降解1 μmol 过氧化氢所需的酶量定义为1 个酶活单位。

1.6 过氧化氢酶酶学特性分析

1.6.1 过氧化氢酶动力学参数 用pH 7.0、50 mmol/L PBS 缓冲液配置10～90 mmol/L 的过氧化氢底物溶液在37 ℃条件下测定酶活。 利用Lineweaver-Burk双倒数法作图计算得到动力学参数Km，Vmax及Kcat值。

1.6.2 pH 及温度对酶的影响 在37 ℃下， 采用不同pH 的缓冲液中测定酶的最适pH。 最适pH 测定所用的缓冲液如下： 柠檬酸钠缓冲液 （50 mmol/L,pH 4～6）, PBS 缓冲液（50 mmol/L，pH 6～8）, Tris-HCl缓冲液（50 mmol/L，pH 8～10） 和 甘氨酸-NaOH 缓冲液（50 mmol/L，pH 10～13）. 在4 ℃下，将酶浸入不同pH 的缓冲液中静置24 h 后测定剩余酶活，得出该酶的pH 稳定性曲线。 在最适pH 条件下，在10～60 ℃之间测定最适反应温度。 将在不同温度下置于不同时间, 冰上放置15 min 后测定剩余酶活，得出该酶的热稳定性曲线。

1.6.3 金属离子的影响 将酶分别加入含有1 mmol/L不同的金属离子（Ni2+、Mn2+、Zn2+, Mg2+、Cu2+、K+、Fe2+和Co2+） 的磷酸缓冲液（50 mmol/L, pH 7.0）10 min后测定酶活，以不添加金属离子的磷酸缓冲液作为对照。

1.7 结构建模

利用SWISS-MODEL protein modeling server（http://swissmodel. expasy.org/）， 以 短 小 芽 孢 杆 菌MTCCB6033 过氧化氢酶(PDB id: 4qol. PubMed id:25663126) 为模板进行同源建模。 利用Discovery Studio Client 2.5 和PyMOL View 软件来得到突变后的模型结构并分析二级结构的改变。 用PoPMuSiC-2.1 algorithm 工具来找寻可能提高热稳定性的突变位点，并计算其吉布斯自由能[30]。

2结果与讨论

2.1 突变位点的选择

在本实验中， 以短小芽孢杆菌MTCCB6033 过氧化氢酶蛋白质(PDB id:4qol.PubMed id:25663126)结构为模板， 构建了野生型和突变株的3D 结构。Swiss model 选择的模板与同源建模得到的结构有99.39% 的相似性。

KatX2 由4 个相同的亚基组成， 每个亚基有3个对催化起关键作用的氨基酸残基（His57、位于血红素腔的Asn130 以及在保守区域的Asn130）[31]。利用PoPMuSiC-2.1 algorithm 工具预测了各个残基突变后自由能的改变，根据预测的结果，我们选择了其中自由能最低的3 个突变株（K117V、K117I 和K117M 的折叠自由能分别为-2.23, -2.58 kcal/mol和-1.84 kcal/mol）进行突变。同时考虑到位于活性中心附近α-螺旋的氨基酸残基对酶的热温度性起到关键作用，并且苯丙氨酸对蛋白的稳定性有关键作用[32]，因此我们将M177 突变成苯丙氨酸。 构建4 个过氧化氢酶突变体，并在枯草芽孢杆菌168 中进行表达。

2.2 过氧化氢酶的过表达和纯化

通过SDS-PAGE 分析表明，B. subtilis 168/pMA5-KatX2 以及分别含有KatX2 突变体K117V、K117I、 K117M 和M177P 的重组菌均构建成功。 纯化后，SDS-PAGE 分析表明纯化效果较好无杂质蛋白条带，氧化氢酶相对分子质量大小为5.8×104（图1）。 野生酶和突变株K117V、K117I、K117M、M177P的比酶活分别为27559、36297、33582、29896 U/mg和31024 U/mg。

表2 突变前后酶反应动力学参数Table 2 Kinetic parameters of the purified wild-type catalase (KatX2) and its mutants

图1 野生型过氧化氢酶KatX2 及其突变株K117V、K117I、K117M 和M177P 纯化后的SDS-PAGE 分析Fig.1 SDS-PAGE analysis of the purified wild-type KatX2 and its mutants K117V，K117I，K117M and M177P

2.3 过氧化氢酶突变体酶学特性分析

过氧化氢酶突变前后的酶学特性如表2 所示。将K117 分别突变为疏水性的残基（Val、Ile 和Met）比酶活分别提高了31.7%、21.8%和8.48%，60 ℃的半衰期分别提高了38、23 min 和9 min。 K117V 和K117I 的kcat分别为319427 s-1和317185 s-1，比野生型展现出更高的催化效率。 根据结构分析可知，117 位的赖氨酸突变为疏水的缬氨酸后，会与92 位的苯丙氨酸形成2 个氢键的连接，并且与疏水性的93 位缬氨酸和119 位酪氨酸共同形成一个疏水性的孔道（图2（b））。 疏水性的孔道与位于血红素附近主孔道的催化残基Asp110 和Asn130 相连接。之前的研究报道表明，活性位点附近的疏水性对酶的稳定起关键作用[33]，疏水区域由于能增强稳定性，这可能是因为它增强了α-螺旋和β-折叠结构域之间的联系，而这一点与作为底物结合位点的配体有关[31]。 因此117 位亲水性的赖氨酸突变为疏水性的缬氨酸并在活性中心形成疏水区域是提高酶热稳定性的原因。 将Lys117 突变为其他疏水氨基酸（异亮氨酸和蛋氨酸） 加强了与周围Phe114、Ala115、Val116、Phe118 和Tyr119 的相互作用，使疏水区域更加稳定， 从而提高了酶的催化效率和热稳定性。另外，将Met177 突变成脯氨酸，脯氨酸起着维持蛋白质形状和折叠的重要作用，从而提高蛋白质构象稳定性和催化效率[32]. 如图2（c）和2（d）所示,Met177和突变株P177M 通过同样的氢键与Trp180、Leu181 和Ser174 形成极性连接， 但是热稳定性和催化活性却有所差异，这可能是由于脯氨酸残基能提高构象的稳定性所导致的。

2.4 温度、pH 和金属离子对突变体的影响

突变后，最适催化温度未发生改变，均为40 ℃（表3），这与B.pumilusB4W 来源的过氧化氢酶相同[22]。 该结果与此前报道的常温微生物来源的过氧化氢酶在15～55 ℃相一致[34]。所有的突变株在40 ℃下均保持良好的热稳定性，在20 ℃下储藏20 h，酶活能保留90%以上。 在60 ℃，酶活下降速度显著加快，野生型在60 ℃下的半衰期为220 min（见图3），突变体K117V 在60 ℃下的半衰期提高了38 min。

图2 过氧化氢酶及其突变的结构分析Fig.2 Structural model analysis of the wild-type KatX2 and its mutants

表3 突变前后过氧化氢酶酶学特性Table 3 Characterization and thermostability of the wild-type catalase (KatX2) and its mutants

图360 ℃下野生型过氧化氢酶及其突变株热稳定性Fig.3 Thermo-stability of the wild-type KatX2 and its mutants at 60°C.

此外， 作者研究了野生型和突变株的pH 稳定性。 结果如图4 所示，突变前后在pH 7 的条件下均较稳定， 能保留95%的酶活。 突变株K117V 在pH 12 的条件下保留了67%的酶活，展现出比野生型更好的pH 稳定性。其他突变株在pH 4.0～13.0 的条件下，pH 稳定稳定性与野生型相似。 作者同样研究了金属离子对突变后酶活的影响。 如图5 所示，金属离子对过氧化氢酶突变前后的影响基本一致。 Fe2+和Mg2+对酶活有促进作用。 Co2+对酶活有一定的抑制作用， Cu2+对过氧化氢酶有较强的抑制作用，但与较野生型相比较，Cu2+突变株K117V 抑制性有所降低。

图4 pH 对过氧化氢酶稳定性的影响Fig.4 Effect of pH on enzyme stability of the wild-type KatX2 and its mutants

图5 金属离子对过氧化氢酶酶活的影响Fig.5 Effect of metal ions on the activities of wild-type KatX2 and its mutants

3结 语

通过对B. pumilusML413 血红素过氧化氢酶K117 进行定点改造，提高了过氧化氢酶的热稳定性和催化活力。 突变株K117V 在60 ℃的半衰期提高了38 min, 并且比酶活提高了31.7%， 其他的突变株在热稳定性和催化能力上也有所提高。 我们从酶分子结构上对造成热稳定性和酶学特性提高的原因进行了分析，疏水性氨基酸以及脯氨酸的引入是造成该变化的原因。 突变后的过氧化氢酶显示出更好的适用范围，具有工业化应用的潜力。