ULIHO Alphonse， 杨套伟， 苑曼曼， 徐美娟， 张 显，MUGISHA Samson， 周俊平， 饶志明*

（1. 江南大学 生物工程学院， 江苏 无锡214122；2. 江南大学 工业生物技术教育部重点实验室， 江苏 无锡21412）

氨肽酶（EC 3.4.11）广泛存在于原核生物和真核生物细胞中，该类酶主要生理功能是从N 末端切割肽或蛋白质[1-4]。 微生物因具有多样性、易培养等特点，是氨肽酶最重要的来源之一。 据报道，链霉菌属、曲霉属、假单胞菌属和芽孢杆菌属均能产生氨肽酶[5-9]。 与动物和植物氨肽酶相比，微生物氨肽酶由于其催化效率高，稳定性好和容易生产而在工业上广受欢迎。 此外，氨肽酶具有广泛的底物特异性，在分子测序，药物和食品工业等多种领域得到广泛应用。 在食品工业中，氨肽酶主要用于水解蛋白质水解物、蛋白质和肽等。 此外，氨肽酶还被用于调味品的食品添加剂，用于提升调味品的营养价值和口味[6]。 近年来，已有研究报道通过定点改造提高氨基肽酶的热稳定性等。

枯草芽孢杆菌具有安全性、生产快、产酶广等特征，广泛应用于酶的生产[8]。 最近，来自枯草芽孢杆菌Zj016 的氨肽酶（BASP）已被表征为金属氨肽酶， 它与由枯草芽孢杆菌168 来源的氨肽酶编码基因ywaD 序列相似性较高。 这2 种氨肽酶（YwaD 和BSAP）都属于氨基肽酶28 家族。该家族中来源于链霉菌灰色氨肽酶 （SAG）， 链霉菌Th-2 氨肽酶（SSAP）和嗜热气单胞菌氨基肽酶（AAP）结构和催化机制模型已被解析[7,10]。基于同源建模和结构分析表明， 氨肽酶BSAP 和YwaD 都具有长约150 个氨基酸的底物结构域， 其含有2 个α-螺旋和7 个β-折叠。

在本研究中，旨在通过定向突变技术改变底物结合区域的氨基酸残基的疏水性，考察其对氨肽酶热稳定性的影响。 基于氨基肽酶YwaD 同源建模和结构分析， 发现在底物结合区存在一些亲水残基；随后， 我们尝试利用疏水残基取代这些亲水残基，以增加该区域的疏水相互作用，为该蛋白质结构提供更多的刚性，从而提高其热稳定性。 我们首先选取了6 个亲水残基位点，随后发现，只有第385 天冬酰胺被疏水性残基L385 取代时， 其与其邻域氨基酸的疏水相互作用增强，进而导致该酶的热稳定性增加。

1材料与方法

1.1 试剂、菌株和质粒

Bacillus subtilis 168、E. coli JM109、pMA5 质粒由本实验室保藏； 限制性内切酶、DNA 连接酶、ExTag DNA 聚合酶，购自大连宝生物公司；用于定点突变的快速同源重组试剂盒，购自生工生物工程(上海)股份有限公司；底物氨基酰基-硝基苯胺，购自上海麦克林生物化学公司（中国）；其他溶剂均为商业化产品。

1.2 重组菌株的构建

以B. subtilis 168 来源的氨肽酶YwaD 的DNA序列为模板设计引物，同时设计了突变体所需引物序列（表1），引入了6 个组氨酸标签（6×His 标签），便于后期分离纯化。

表1 实验所需引物Table 1 Primers used in this work

以B. subtilis168 染色体DNA 为模板， 利用引物对ywaD-F/ywaD-R，通过聚合酶链式反应（PCR）扩增获得ywaD基因。 将PCR 产物经纯化后，与表达载体质粒pMA5 连接， 获得重组质粒pMA5-ywaD，按照文献[11]报道的方法，将经过测序验证正确的重组质粒pMA5-ywaD 转化到B. subtilis168中，获得重组菌株B. subtilis168/pMA5-ywaD。

利用引物对ywaD-F (N385L)/ywaD-R(N385L)，以pMA5-ywD 为模板，并使用高保真DNA 聚合酶,通过PCR 扩增将所需的突变N385L 插入到ywaD基因中获得突变基因。 将纯化后PCR 产物用exnaseII 酶在37 ℃处理30 min 后，用Dpn I 酶消化完全甲基化和未突变的亲代DNA 1 h 以提高突变效率[12]。 将得到的质粒经进一步测序验证，以确保突变成功。 然后将突变正确的重组质粒pMA5-N385L 转化到枯草芽孢杆菌168 中，获得重组菌株B. subtilis168/pMA5-N385L。

1.3 菌株培养及氨肽酶的制备

发酵培养基：23.6 g/L 酵母提取物、11.6 g/L 胰蛋 白 胨、9.4 g/L K2HPO4、2.2 g/L KH2PO4、4 ml/L 甘油、0.6 mml/L Co2+和50 μg/mL 卡那霉素，调节pH至pH（7.2±0.2）。 重组菌株B.subtilis168/pMA5-ywaD 和B. subtilis168/pMA5-N385L 分别在37 ℃、180 r/min培养36 h，然后4 ℃、10000 r/min 离心10 min 收集发酵液上清液，收集的上清液即为氨基肽酶粗酶液。

将体积分数60%的无水乙醇加入到上述氨基肽酶粗酶液进行酶液浓缩， 然后4 ℃，10000 r/min离心20 min 收集样品沉淀。接着，将样品沉淀重悬于50 mmol/L Tris-HCl 缓冲液（pH 8.5）中进行透析，每12 h 后更新一次缓冲液，透析48 h。随后，将用4.5 μm滤膜过滤后的样品加入到装有DEAE-Sepharose Fast Flow 柱（GE Healthcare，USA）Ni2+-NTA（次氮基三乙酸酯）AKTA 纯系统中，用阴离子交换柱进行分离纯化（流速0.5 mL/min， 结合缓冲液：0.02 mol/L Tris-HCl buffer, 0.5 mol/L NaCl, pH 7.4)。 粗酶液吸附至1 mL HisTrapTMHP 纯化柱上后， 用剂量1 mL咪唑进行梯度（0～500 mmol/L） 洗脱。 最后， 通过SDS-PAGE 分析纯化后酶的纯度[13]。 根据Bradford方法进行蛋白质浓度测定[14]。

1.4 酶活测定

根据文献[15-19]报道的氨肽酶测定方法略微进行了改进， 用于检测突变型N385L 和野生型氨肽酶YwaD 酶活。1.5 mL 反应体系：50 mmol/L Tris-HCl缓冲液（pH 8.5），适量的纯化酶，4 mmol/L 的L-亮氨酸-对硝基苯胺（L-Leu-pNA）底物，40 ℃反应10 min，随后加入1.5 mL 无水乙醇终止反应。 在405 nm 处测量吸光值。 氨基肽酶酶活定义：1 min 释放1 μmol/L 对硝基苯胺所需的酶量为一个单位（U）。 用Bradford 法测定样品中蛋白质含量[14]。 所有实验均独立重复3 次。

1.5 氨肽酶酶学特性表征

1.5.1 温度和pH 对酶活性和稳定性的影响 将纯化后的野生型和突变体氨肽酶分别置于20～80 ℃环境中，考察其最适反应温度和热稳定性。在pH 6.0～11.0范围内考察其最适pH，使用50 mmol/L 的不同缓冲液：磷酸盐缓冲液（pH 6.5～7.5），Tris-HCl 缓冲液（pH 8.0～9.0），碳酸盐缓冲液（pH 9.5～11.0）。所有实验均独立重复3 次。

1.5.2 金属离子氨肽酶活性的影响 在含有0.1 mmol/L 或 1 mmol/L Ca2+（CaCl2），Mg2+（MgSO4·7H2O），Mn2+（MnCl2·4H2O），Cu2+（CuCl2·2H2O），Ni2+（NiCl2·6H2O），Co2+（CoCl2·6H2O），Zn2+（ZnCl2） 的50 mmol/L Tris-HCl 缓冲液（pH 8.5）中测定二价金属离子对氨肽酶的影响。为了检测抑制剂/螯合剂对氨肽酶的影响， 使用了以下抑制剂：PMSF、 卡巴明、EDTA、SDS 和Bestatin。 对照组采用纯酶与50 mmol/L（pH 8.5） 的Tris-HCl 缓冲液混合而不添加任何离子或抑制剂。 所有实验均独立重复3 次。

1.5.3 动力学参数测定 在不同底物浓度（0.5～5mmol/L）下测定动力学参数， 例如Km、Kcat和Kcat/Km。 使用Lineweaver-Burk 曲线来估计Km和Vmax， 该曲线符合Michaelis-Menten 方程[17，20]。所有实验均独立重复3 次。

1.6 结构分析

将ywaD 基因序列（Gene bank：AGA22702.1.1）提交到蛋白质结构模型数据库（https://www.swissmodel.expasy.org） 所生产的PDB （蛋白质数据库） 结构作为比较模型。 相关结果采用软件Studio software 2.5 进行分析。

2结果与讨论

2.1 蛋白质和结构分析的比较同源性

根据网站https://www.swissmodel.expasy.org 生成的B. subtilis168 来源的氨肽酶PDB 3D 结构和软件Studio software 2.5 分析，我们初步选择了底物结 合 区 的6 个 氨 基 酸 残 基（ASN338、ASN385、GLY389、PHE386、PHR366 和THR393）作为突变对象，根据初步实验结果，发现N385 残基突变为疏水性残基L385 时，氨肽酶酶活和热稳定性较好。

图1 SDS-PAGE 分析氨肽酶及突变体N385LFig. 1 SDS-PAGE analysis of the purified wild-type YwaD and its mutant N385L

根据SDS-PAGE 分析，野生型氨肽酶和突变体N385L 分别成功在枯草芽孢中过量表达， 氨肽酶相对分子质量大小为49450 （图1）。 重组菌株B.subtilis168/pMA5-ywaD 与B. subtilis168/pMA5-N385L 发酵液中氨肽酶酶活基本一致，为50.96 U/mL左右。 这与枯草芽孢杆菌Zj016 来源的氨肽酶在B. subtilis168 过表达的酶活力（（52±1.9） U/mL）基本一致，可能原因是采用了相同的信号肽[21]。而野生型YwaD 和突变体N385L 的比活力分别为134.3 U/mg 和129.6 U/mg，即N385 位点突变对其比活力略有影响。

2.2 动力学参数分析

参照材料和方法部分所述方法测定Kcat、Km和催化效率（Kcat/Km）。 如表2 所示，与野生型相比，突变型N385L 对底物的亲和力提高了47.4%，催化效率提高了28.5%。其主要原因可能是，突变体底物结合区域中的疏水相互作用的提高使酶和底物结合更紧密。

表2 氨基肽酶及其突变体N385L 动力学参数Table 2 Kinetic parameters of the purified wild-type YwaD and its mutant N385L

2.3 氨肽酶酶学特性表征

2.3.1 温度对重组氨肽酶的影响 由图2（a）可知，N385L 位点的突变对氨肽酶的最适催化温度没有影响，突变前后最适温度均为40 ℃，这与枯草芽孢杆菌Zj016 来源的氨肽酶最适温度（55 ℃）不同[10，21]。较低的最适反应温度在工业生产过程中更具有优势，因为其需要更少的热量。

由图2（b）可知，N385L 位点的突变能够提高氨肽酶的热稳定性， 在80 ℃放置30 min 时， 野生型YwaD 完全失活，而突变体N385L 仍保留20%的酶活力。另外，在最适催化温度（40 ℃）下温育36 h，突变体N385L 能够保持80%以上活力， 而野生型YwaD 在相同条件下仅保留60%的活力。 这种热稳定性的增加， 是由底物结合区域中的L385 取代亲水性残基N385 引起的。 该疏水性残基L385 代替N385 直接与底物接触，增加了底物与氨肽酶YwaD的疏水相互作用。 显然，增强的疏水性相互作用更稳定了过渡态，使酶具有更好的稳定性。 另外，疏水性相互作用的存在缩短了底物与酶之间的距离，并使它们接触更紧密，提高了酶的稳定性。Gao 等通过序列分析发现在氨肽酶非催化区域含有一段热敏域，通过删除该热敏域片段，氨肽酶在30min 内半衰期从71 ℃提高至77 ℃[1]。

2.3.2 pH 对重组氨肽酶的影响 如图3（a）所示，突变体N385L 在碱性pH（pH 8～9）范围中显示出良好的活性，最适pH 为8.5，这与之前报道的其他氨肽酶相一致[16，22-25]。随后考察了酶的pH 稳定性（图3（b）），当低于最适pH 8.5 时，突变体N385L 的活力随着反应时间的延长而增加（12 h 内），但高于最适pH 8.5时，突变体N385L 的活力随着反应时间的延长而轻微降低。 显然，突变型氨肽酶N385L 可以长时间在最佳pH 下工作。

图2 温度对突变体N385L 活性和稳定性的影响Fig. 2 Temperature effect on the activity and stability of mutant N385L

图3 pH 对突变体N385L 活性和稳定性的影响Fig. 3 pH effect on the activity and stability of mutant N385L

2.3.3 金属离子对重组氨肽酶的影响 添加0.1 mmol/L 金属离子时， 野生型酶和突变体N385L 被Co2+离子激活， 且突变体N385L 被高度激活（192.2%），证实该氨肽酶是金属氨肽酶。 金属离子对野生型和突变体N385L 表现了抑制作用均为：Mn2+＜Mg2+＜Cu2+＜Ca2+＜Ni2+＜Zn2+， 高浓度的金属离子对氨肽酶抑制性加强（表3）。 这些现象与之前的研究报道一致，不稳定的锌离子可被钴离子取代可以增强酶的稳定性[19，26]。

表3 离子对重组氨肽酶N385L 突变体的影响Table 3 Effect of metal ions on the activity of mutant N385L

3结 语

氨肽酶因具有广泛的底物谱使其在药物和食品工业等多种领域得到广泛应用[27]，本研究中基于氨肽酶底物结合区域氨基酸特性分析，将枯草芽孢杆菌来源氨肽酶第385 位亲水性氨基酸残基N 突变为疏水氨基酸残基L， 突变体N385L 稳定性、对底物氨基酰基-硝基苯胺的亲和力和催化效率得到明显提高。 因此，本研究中获得的具有良好工业属性的氨基肽酶将具有更好的工业应用前景。