刘晓光， 顾翰琦 ， 单梅华， 张 帆， 李 焱， 徐宵月， 董建新

(河北民族师范学院生物与食品科学系， 河北 承德 067000)

金莲花(TrolliuschinensisBunge)又称旱荷、旱金莲、陆地莲等，为毛茛科金莲花属一年生或多年生草本植物，多生长在海拔1 800 m以上的高山草甸或疏林地带[1]。金莲花在中国分布较广泛，但尤以河北塞罕坝地区所产为佳品，是优良的园艺花卉植物[2-4]。金莲花花朵有极高的药用价值，可抗菌消炎[5]、治疗咽炎及上呼吸道感染[6]等，其黄酮具有较好的抗氧化作用[7]，其药渣可进行发酵生产高蛋白发酵物[8]。严力群研究显示，金莲花茎叶中黄酮含量与花朵中的含量基本持平[9]。对金莲花的掠夺性采摘，加上塞罕坝景区旅游人群的增多，金莲花的生境遭到严重破坏。近年来，围场连年干旱也严重影响了金莲花的生长和繁殖，诸多原因导致金莲花数量以每年10%的速度急剧下降[10]。因此，金莲花的资源保护成为需要迫切解决的问题。近年来，有关金莲花的研究大多集中于金莲花药理成分、医药制剂等方面[11-15]；而有关其育种，繁殖的研究较少。部分研究者[4,16]采用野生抚育的方式进行繁殖，但抚育需要大量的土地和时间，并且存在存活率低，生长速度慢等问题，仍无法满足市场所需。而利用现代生物技术手段进行的研究较少，但灭菌方面存在较大问题，导致污染严重，繁殖系数低[17]，郑志新[18]等对金莲花快速繁殖体系进行了优化，但仍存在增长速率慢，幼苗畸形，褐化等问题。因此对于金莲花发育迟缓、无菌苗生长缓慢、继代不稳定等问题成为当前重要的研究工作[17]。金莲花大多采用种子繁殖，但由于其种子本身存在休眠特性造成萌发率低，而对此方面的研究[17-22]结果差异较大。鉴于金莲花的价值高且种子昂贵，即使种子贮藏时间较长也应加以利用。本研究以贮藏2年的金莲花种子为材料，摸索适合其发芽的条件、培养基激素配比以及适宜基质种类，旨在为其种质保育和扩大繁殖栽培提供参考。

1 材料与方法

1.1试验材料

金莲花种子取自承德市塞罕坝，在室温下保存2年。

1.2试验方法

1.2.1非离体条件下不同因素对金莲花种子萌发及生长的影响

1) 不同浓度GA3对金莲花种子萌发的影响。

种子用75%酒精消毒30 s，无菌水冲洗3次，再用升汞浸种10 min，无菌水冲洗3次之后，将金莲花种子用浓度分别为200，300，400，500，700，900 mg·L-1的GA3在25 ℃分别浸种2 d。以清水在25 ℃分别浸泡2 d作对照，分别放入铺有2层湿润滤纸的培养皿中，每个处理30粒种子，重复3次。将种子置于植物组培室，光照时间16 h·d-1，温度为(25±1)℃。从放入培养皿中开始计算，以15 d为1个统计周期，统计萌发率、成苗率以及开始萌发时间。其中以胚根突破种皮为萌发标准。

2) 不同浸种时间对金莲花种子萌发的影响。

将灭菌的金莲花种子用上述探究出的最适GA3溶液，在25 ℃的环境下浸种，设置时间为1、2、3 d，浸种完成后将其置于铺有湿润滤纸的培养皿中进行培养。定期适量浇水，保持湿润。每个处理30粒种子，重复3次。

3) 不同浸种温度对金莲花种子萌发的影响。

种子用75%酒精消毒30 s，无菌水冲洗3次，再用升汞浸种10 min，无菌水冲洗3次之后，采用上述探究出的最适的GA3浓度及浸种时间，将种子分别在25 ℃和4 ℃条件下浸泡，浸泡完成后放入铺有2层湿润滤纸的培养皿中，置于25 ℃条件下进行发芽试验。每个处理30粒种子，重复3次。统计依据同上。

4) 不同基质对金莲花幼苗生长的影响。

用以上试验筛选出的最适打破种子休眠的方法，采用无菌消毒方法处理种子后，将种子置于铺有湿润滤纸的培养基中进行培养，当胚根长1～2 mm时进行移栽，将萌发的种子以点播的方法播于装有不同基质的花盆中，覆土厚度5～10 mm，生长2个月后，开始记录其成苗率，株高，叶片数量，叶片面积。其中不同基质分别为纯草炭土、混合基质1(草炭土︰蛭石的体积比为2︰1)、混合基质2(草炭土︰蛭石︰珍珠岩的比例为3︰2︰1)、每种基质12株，重复3次。

1.2.2离体条件下不同激素种类及配比对金莲花种子萌发的影响

1) 不同浓度GA3对金莲花种子萌发的影响。

将金莲花种子用上述方法灭菌后，采用400、800 mg·L-1的GA3分别在4 ℃条件下冷浸4 d；并以无菌水冷浸相同的时间作为对照，然后将其在无菌条件下接种于1/2 MS+1 mg·L-16-BA+0.5 mg·L-1NAA的培养基[17]中。以20 d为1个周期，统计其发芽率，成苗率以及开始萌发时间，以种子突破种皮为萌发标准。

2) 不同激素组合对金莲花种子萌发的影响。

在超净工作台中，将种子用75%酒精消毒30 s，无菌水冲洗3次，再用升汞浸种10 min，无菌水冲洗3次之后，采用上述最适处理条件对金莲花种子进行处理，然后分别接种到含不同浓度TDZ、IBA、6-BA和NAA的培养基中(见表1)。以不含任何激素的组为对照，置于(25±1)℃下培养。以萌发率、成苗率、开始萌发时间为指标，筛选种子无菌播种最适培养基配方。

表1 不同激素种类及浓度配比

处理TDZ/(mg·L-1)IBA/(mg·L-1)6-BA/(mg·L-1)NAA/(mg·L-1)ck0.00.000.0A10.10.500.0A20.20.500.0A30.10.200.0A40.20.200.0B10.00.010.5B20.00.020.5B30.00.010.2B40.00.020.2

1.3指标测定

萌发率(%)=(萌发种子数/供试种子总数)×100%；

成苗率(%)=(幼苗数/萌发的种子总数)×100%；

叶幅(cm2)=叶长×叶宽。

株高(cm)采用直尺测量植株高度，以土壤表面到植株最高点为株高测量标准，叶片数采用单株金莲花所有叶片记数。

1.4数据分析

数据采用Excel 2010软件和SPSS 20.0软件进行处理。

2 结果与分析

2.1不同条件因素对金莲花种子萌发及生长的影响

2.1.1不同浓度GA3对金莲花种子萌发的影响

由表2可知，使用200～500 mg·L-1GA3处理金莲花种子均可打破其休眠，但不同浓度GA3处理的效果不同。在200～900 mg·L-1浓度范围内，随着GA3浓度的增加，金莲花种子的萌发率、成苗率呈先增高后下降的趋势，当浓度达到400 mg·L-1时，萌发率和成苗率达到最高，其中萌发率与其他处理差异性显著；GA3浓度为700 mg·L-1和900 mg·L-1时，种子的萌发率低于对照，表明浓度过高对种子萌发有抑制作用。GA3浓度为400 mg·L-1时，成苗率最高，其次是300、500 mg·L-1的处理，三者之间差异不显著，但显著高于其他处理。从萌发时间来看，GA3浓度为200～500 mg·L-1时，可明显缩短萌发时间，其中400 mg·L-1的处理效果最佳；而GA3浓度为700、900 mg·L-1时对缩短萌发时间的作用不明显。综上所述，适量的GA3浸种可提高金莲花种子的萌发率和成苗率，并可显著缩短其萌发时间， 使用400 mg·L-1的GA3浸种2 d效果最好。

表5 不同基质对金莲花幼苗生长的影响

基质 0～60d 61～120d 株高/cm叶数/片叶幅/cm2株高/cm叶数/片叶幅/cm2纯草炭土3.45±1.03a2.27±0.59a1.52±0.64a6.45±2.13b6.00±1.93a6.22±6.00a混合基质12.41±0.52b2.07±0.46a0.99±0.22b7.31±2.12b5.87±1.89a8.29±5.97a混合基质22.10±0.39b1.87±0.35a0.92±0.38b9.54±2.87a5.53±1.60a8.39±2.84a

注：从上左起至下右设置GA3的浓度依次为0、200、300、400、500、700、900 mg·L-1。图1 不同浓度GA3对金莲花种子萌发的影响

注：a为草炭土，b为混合基质1，c为混合基质2。下同。图2 幼苗前期生长情况(0～60 d)

表2 不同浓度GA3对金莲花种子萌发的影响

GA3浓度/(mg·L-1)萌发开始时间/d萌发率/%成苗率/%0(ck)10.44±1.50a24.07±7.95c41.88±11.23c2007.83±1.30b56.29±4.18b53.78±7.26bc3007.88±1.09b55.18±8.54b59.82±7.18ab4002.56±0.88d71.63±7.91a66.11±6.75a5006.22±1.20bc55.18±6.38b60.68±5.59ab70010.78±1.64a14.44±5.26c44.84±8.14bc90010.89±1.36a15.17±5.03c49.94±8.87bc

注：小写字母表示处理间存在显著性差异(p<0.05)。下同。

2.1.2不同浸种时间对金莲花种子萌发的影响

将金莲花种子在GA3溶液中浸泡不同时间后催芽，结果如表3所示。不同浸种时间对种子的发芽率和成苗率的影响不同，浸种2 d的种子萌发率、成苗率均显著高于1 d、3 d的处理，为提高金莲花萌发速率的最适宜处理时间。

2.1.3不同浸种温度对金莲花种子萌发的影响

金莲花种子用400 mg·L-1浓度GA3分别在25 ℃和4 ℃的条件下浸种2 d，然后置于25 ℃的环境下进行培养，结果如表4所示。通过独立样本T检验分析可知，在25 ℃和4 ℃ 2种温度下浸种后，其萌发率，成苗率以及萌发开始时间差异不显著。因此，不同浸种温度对金莲花种子的萌发基本没有影响。

2.1.4不同基质对金莲花幼苗生长的影响

将胚根长为3～5 mm的金莲花种子以点播的方式播种在不同的基质中，前期每天浇水保持基质湿润，后期每2～3 d浇1次水。由于金莲花为多年生草本植物，生长较慢，因此，以2个月为1个时间点将其培养阶段分为前期和后期。然后分别对这2个时期幼苗的株高、叶数及叶幅进行统计对比。试验结果及统计0～60 d和61～120 d的幼苗生长情况如表5和图2、图3所示，幼苗生长前期，纯草炭土中幼苗的株高和叶幅高于其他处理；但3 种处理的叶片数均在2片左右，差异不显著。幼苗生长后期与前期生长情况略有差异，3种基质在叶数、叶幅方面均无显著差异，而混合基质2中的幼苗株高显著高于其他处理。因此，在幼苗生长前期最好用纯草炭土培养，而后期则需要储水性能更好的混合基质2作为培养基质。

表3 浸种时间对金莲花种子萌发的影响

浸种时间/d萌发开始时间/d萌发率/%成苗率/%17.58±3.37a41.48±9.35b48.53±8.25b26.75±2.59a51.64±7.58a59.94±6.09a38.54±3.40a39.71±8.64b47.66±9.46b

表4 浸种温度对金莲花种子萌发的影响

浸种温度/℃萌发开始时间/d萌发率/%成苗率/%253.67±1.9772.0±7.3569.43±5.0544.83±2.4878.98±2.5875.06±6.09

图3 幼苗后期生长情况(61～120 d)

注：a～i依次对应的为ck、A1、A2、A3、A4、B1、B2、B3、B4处理。图4 金莲花种子无菌发芽效果

表6 不同浓度GA3对金莲花种子萌发的影响

GA3/(mg·L-1)萌发开始时间/d萌发率/%成苗率/%ck10.00±1.00a17.78±1.92b55.56±7.05a40011.67±2.08a17.78±5.09b39.52±6.33a8004.33±0.58b43.33±3.34a53.66±3.57a

2.2无菌条件下不同激素种类及配比对金莲花种子萌发的影响

2.2.1不同浓度GA3对金莲花种子无菌萌发的影响

金莲花种子经过2种不同条件处理完成后，置于培养基中进行萌发培养，统计其萌发率和成苗率如表6所示，培养基中种子的萌发率随GA3浓度增加而升高。使用800 mg·L-1GA3浸泡过的种子，在培养基中萌发率最高，与其他处理差异显著；萌发开始时间与其他处理相比可缩短一半。因此，采用800 mg·L-1GA3在4 ℃条件下浸种4 d，可使金莲花种子在培养基中达到较好的萌发效果。

2.2.2不同激素配比对金莲花种子无菌萌发的影响

不同激素种类及浓度配比可以对金莲花种子的无菌萌发效果产生直接影响。试验结果如表7和图4所示，采用TDZ、IBA激素组合进行无菌播种，与6-BA与NAA激素组合相比，种子的萌发率与成苗率相对较高，但发芽时间无明显差别。从萌发率看，当 IBA浓度为0.5 mg·L-1时，种子的萌发率显著高于其他处理。从成苗率看，TDZ、IBA激素组合成苗率偏高且稳定，处理间无显著差异，而6-BA与NAA的激素组合成苗率和萌发率均不及与TDZ和IBA组合的处理。试验表明，金莲花种子的最适无菌萌发培养基为MS+0.1 mg·L-1TDZ+0.5 mg·L-1IBA。

3 讨 论

3.1金莲花种子具有休眠的特性，前人研究表明， GA3可有效打破种子休眠[1,19-24]。本试验中400 mg·L-1GA3浸种2 d萌发率最高，可达到71.63%，其结果相对偏低[22-24]。可能是由于对金莲花种子的处理方法不同、金莲花种子的产地不同，以及种子贮藏时间过长(2年)、种子饱满程度低等原因所致。金莲花种子珍贵，应尽最大程度加以保护利用，因此，为提高其种子的萌发率，采用GA3浸种时，应根据种子的具体情况对GA3的浓度及浸种时间作相应调。

表7 不同激素组合对金莲花种子萌发的影响

处理萌发率/%萌发开始时间/d成苗率/dck36.67±10.00c6.67±0.57a27.60±7.73bA168.45±1.67a5.00±0.0ab51.11±11.70aA266.67±6.10a5.00±0.0ab55.44±6.07aA352.22±5.09b5.00±0.0ab44.84±4.51aA451.11±6.94b4.33±0.57b42.36±7.64aB138.88±8.78c5.00±0.0ab11.11±9.24bB253.33±8.82b5.00±0.0ab42.40±8.58aB345.55±8.38c4.33±1.53b10.52±6.64bB447.78±5.09b4.00±1.73b53.06±8.34a

3.2关于金莲花种子的无菌萌发，前人已有所研究，如胡海英等人探究出最适无菌条件为MS+0.1 mg·L-1TDZ+0.5 mg·L-1IBA；郑志新等[18]则认为以MS为基本培养基，添加1 mg·L-16-BA+0.5 mg·L-1NAA效果最好；而本试验研究出的最佳培养基与胡海英的结果接近，且萌发率可提高到66.45%，萌发开始时间也可提早，其原因可能是由于采用的GA3浓度较高，以及可能与激素种类以及激素间的相互作用有关，但具体是哪种因素起主导作用还有待进一步的深入研究。