孟雅菲，申 铁*，彭 棋，陈 震

(1.贵州师范大学贵州省信息与计算科学重点实验室，贵阳 550000;2.贵州师范大学数学科学院，贵阳 550000)

清洁能源是一种不产生污染物的绿色能源，主要包括核能和可再生能源，可用在生活中的各个领域且对环境没有影响.可再生能源是一类能在短时期内，经过自然界的不断循环而不断得到补充的能源，主要有太阳能、生物质能、风能等[1].随着世界石油能源越来越匮乏和全球气候的剧烈演变，清洁能源的开发和使用显得尤为重要.因此，利用高科技手段获取更多的清洁能源，已经成为世界上越来越多的国家能源战略的重要内容.

生物质能作为自然界中一种可再生的清洁能源，具有可获取性强、污染极小、资源总量大的特点，使它成为无可替代的可再生能源之一.生物质能是以生物质为载体，通过光合生物的光合作用将光能转化为储存在生物体内部的化学能，并可转化成各种形态的燃料，用于日常生产生活.生物质能是唯一可以储存和运输的可再生能源.生物质能的有效开发、利用，对世界能源体系的建立和发展有着十分重要的意义.

光合作用是指光合生物利用可见光和光合色素所进行的一系列生化反应[2].这些光合生物通过光合作用将光能转化为储存在生物体内的生物质能，生物质能的产生速率受光合生长速率的影响.研究影响光合速率的因素，可以找到提高生物质能生成速率的方法，以便为实验研究提供可靠依据.生物系统的各组分关系可以用网络来表示，而基于蛋白质层次的代谢网络成为比较热门的研究领域，通过对代谢网络的研究分析，可以推测影响光合生物生长速率的重要基因.

蓝藻作为最早光合放氧的原核微生物，具有遗传背景简单且高效固碳的特点.蓝藻中的丙酮酸铁氧化还原蛋白酶(PFOR)是丙酮酸代谢过程中的关键酶，丙酮酸在PFOR的催化作用下生成乙酰辅酶A和CO2，其中乙酰辅酶A是脂肪酸、氨基酸和糖类等多种有机物代谢过程的中间产物，在许多的代谢过程中都起着至关重要的作用.乙酰辅酶A在生物医学的研究之中已有广泛应用，用于代谢疾病药物以及抗癌药物的研发；在三羧酸循环中也有重要作用，并且可作为合成聚酮化合物类药物的前体分子.由于乙酰辅酶A的药物研究价值，使得促进其合成的酶PFOR成为重要研究对象.有研究报道称，酶PFOR广泛存在于古细菌、真核生物和厌氧原生动物中，由pforA基因编码，并在丙酮酸异化中起到关键的作用.酶PFOR中含有的Fe-S簇蛋白，影响并参与了生物的部分分解代谢途径和合成代谢途径，是重要的参与酶之一.在蓝藻的光自养性生长过程中，是一种氧敏感酶；敲除酶PFOR会更利于蓝藻的生长，使得光合生长速率提高[3].因此，对酶PFOR的功能研究有待进一步证实与探究.

实验研究是单点式，逐步研究是一个假设驱动的过程，周期较长.利用计算、仿真等方法，则可以提供初步的猜想、解释，也在研究基因对蓝藻代谢的作用中有重要价值.本实验采用通量平衡分析方法(FBA)、通量可变性分析方法(FVA)和多目标优化方法(MOO)来研究蓝藻代谢网络(iJB785模型)中酶与光合生长速率的关系，推测出影响光合生物生长速率的重要基因，从而对后续的实验研究起指导性作用.

1 材料与方法

1.1 实验环境及数据

主机配置：CPU为Intel Core i5-3230M，主频2.60 G，内存12.0 GB.

实验平台：Matlab R2017a，Cobra Toolbox 2.0，libSBML 5.16.0，SBML Toolbox 4.1.0.

实验数据：本实验数据采用BIGG数据库提供的代谢模型iJB785为实验研究对象，包括蓝藻中心代谢过程的全部信息[4].

1.2 方法介绍

1.2.1 通量平衡分析方法 通量平衡分析方法(Flux Balance Analysis，FBA)是一种基于约束的模拟方法，在假设代谢系统处于一个稳定状态及目标函数达到最优的前提下，加入化学计量系数等约束条件，将代谢网络封闭在一个可行区域，使用线性规划(LP)方法得到最优解，并计算出该代谢网络的通量分布[5].FBA方法可以用于计算、预测代谢流分布，并通过这些信息反映生物代谢系统的生理特性和评估影响生物生长的重要因素.

FBA方法是基于静态的代谢网络分析方法，广泛用于生物代谢网络中代谢物通量的研究，通过通量值可预测生物的生长速率和代谢物生成速率.FBA方法应用于研究的时间较早，后续的通量分析方法也是以其为基础而进行更深入的实验探究.目前，该方法已经在大肠杆菌、幽门螺杆菌等生物上成功应用，所得的实验结果对生物代谢网络的下一步研究提供更为科学的实验依据.

1.2.2 通量可变性分析方法 通量可变性分析(Flux Variability Analysis，FVA)是基于静态的、在 FBA方法基础上发展而来的通量分析方法，在保证目标反应能够达到最优的前提下，求得代谢网络中每个反应的最小和最大通量值，并得到各个反应的通量可变范围.

必需反应是指在代谢网络达到最优的前提下，通量可变范围总是大于0或总是小于0的反应，由于一个反应通常对应一个或多个同工酶基因，因此与这些反应相对应的基因并非反应所必需的全部基因.除了必需反应外的反应为非必需反应[6].通过FVA方法，可以删除代谢系统中功能相同的基因，来缩小生物基因组的规模，并可以将代谢系统中的所有反应分为必需反应和非必需反应.然后利用单基因敲除方法，去除代谢系统中的某个基因，使该基因所催化的反应通量值变成0.如果计算出来的目标函数值维持原状态不变，则该基因就是非必需基因；反之，如果发生了改变，则为必需基因[7].

1.2.3 多目标优化方法 多目标优化(Multi-objective Optimization，MOO)是同时考虑两个或两个以上的目标函数，并根据目标函数在给定的区域上获得一组最优解的方法，得到的解代表不同目标函数之间的最佳权衡[8].

在自然界和细胞中，不存在单一的一个目标函数，而是不同的细胞目标是相互独立且存在于不同的代谢反应中，通常需要在多个目标函数之中做权衡取舍，并在决策空间中获得一个最优化目标.多目标优化的解决方案是一组无限点集，称为帕累托最优集，因此可将MOO问题的结果表示为帕累托最优集[9].由于线性目标和凸解空间的存在，则可以利用ε约束法来获得帕累托最优集，把多目标优化转化为在目标最大化前提下的一个单目标问题，而另一个目标则合并为不等式约束ε，以此来获得最终的最优解集，并根据所得出的最优解集进行结论性的分析和总结.

2 结果和讨论

2.1 通量平衡分析方法

在如下的图形处理中，由于蓝藻的代谢网络较为庞大，只能选取对比结果中的部分数据作图分析.横坐标代表iJB785模型代谢系统中849个反应的部分反应(90个反应)，其中，第90个反应为目标函数(BIOMASS_1)；纵坐标表示敲除酶PFOR前、后各个反应所对应的通量值(单位：mmol·h-1).

图1是野生型代谢系统中部分反应FBA通量值和敲除酶PFOR后突变型代谢系统中部分反应FBA通量值的对比图，综合横向和纵向分析，在敲除酶PFOR后的突变型代谢系统中，有大多数反应的通量受到了影响.由此可知，酶PFOR敲除后的代谢网络，通过代谢物与辅酶耦连，对离其较远的反应也会产生影响.

图1 敲除酶PFOR后的突变型和野生型部分反应通量值的比较Fig.1 Comparison of partial reaction flux values with mutant and wild-type after knocking out the enzyme PFOR

图2 敲除酶PFOR后突变型和野生型部分反应通量差值Fig.2 Difference between partial reaction flux values with mutant and wild-type after knocking out the enzyme PFOR

图2是敲除酶PFOR后突变型代谢系统与野生型代谢系统中部分反应FBA的差值，第90个反应为目标函数，可依据目标函数值的前后变化来推测敲除某种酶后，对代谢系统是否有影响.由图1、图2可知，野生型目标函数通量值为0.053 9 mmol·h-1，敲除酶PFOR后为0.053 9 mmol·h-1，且敲除酶PFOR前后，FBA通量差值为0 mmol·h-1，即目标函数值保持不变.因此，该代谢系统敲除酶PFOR后，不会对蓝藻的光合生长速率产生影响[10].

综上所述，蓝藻代谢系统中敲除酶PFOR后，有多数反应的通量受到了影响，说明酶敲除后，通过代谢物与辅酶的耦连，对离其较远的反应也会产生影响[11].酶PFOR敲除前后，目标函数通量值保持不变，说明酶PFOR不会对蓝藻的光合生长速率产生影响，即在蓝藻的光自养性生长过程中，酶PFOR不起作用，是一种氧敏感酶.

2.2 通量可变性分析方法

在如下的图形处理中，由于蓝藻的代谢网络较为庞大，只能选取对比结果中的部分数据作图分析.横坐标代表iJB785模型中849个反应中的部分反应，其中，反应BIOMASS_1为目标函数；纵坐标代表各个反应所对应的FVA通量值(单位：mmol·h-1).

图3 野生型代谢系统中部分反应FVA通量值Fig.3 Partially reacted FVA flux values in the wild-type metabolic system

图3是野生型代谢系统中部分反应FVA通量值，即最小通量值(minflux)和最大通量值(maxflux).由图可知，野生型代谢系统中酶PFOR的最小通量值为0 mmol·h-1，最大通量值为0 mmol·h-1.因此，可推测，酶PFOR的FVA通量值应保持在很小范围内，数值大了不利于蓝藻的生长.

图4 敲除酶PFOR后代谢系统中部分反应FVA通量值Fig.4 Partial reaction FVA flux value in the metabolic system after knocking out the enzyme PFOR

图4是敲除酶PFOR后代谢系统中部分反应的最小通量值(minflux)和最大通量值(maxflux)，其中BIOMASS_1是目标函数.综合图3和图4可知，野生型和突变型代谢系统中目标函数minflux值均为0.053 9 mmol·h-1，maxflux均为0.053 9 mmol·h-1.由此可知，敲除代谢系统中通量值为0 mmol·h-1的酶PFOR后，目标函数值保持不变.因此，可推测酶PFOR是代谢系统中的非必需基因[12].

综上所述，FVA方法能够在已经得到FBA方法预测的最优解的前提下，得到代谢系统的通量变化范围，即最小通量值和最大通量值.通过FVA方法的分析，可以将代谢系统中的所有反应分为必需反应和非必需反应，运用单基因敲除方法来筛选出非必需基因[13].依据本实验所得到的数据，野生型代谢系统中酶PFOR的最小通量值为0 mmol·h-1，最大通量值为0 mmol·h-1；敲除通量值为0 mmol·h-1的酶PFOR后，目标函数值保持不变(0.053 9 mmol·h-1)，那么可以推测，酶PFOR的通量值应保持在很小范围内，数值大了不利于蓝藻的生长；酶PFOR为该代谢系统的一个非必需基因.

2.3 多目标优化方法

在如下的图形中，横坐标表示酶PFOR不同的代谢速率(通量值，单位：mmol·h-1)，纵坐标表示目标函数(BIOMASS_1)的生物量(单位：mmol·h-1).

图5 酶PFOR的代谢物速率与生物量产量的关系Fig.5 Relationship between metabolite rate and biomass yield of the enzyme PFOR

图5是利用ε约束法[14]得到的酶PFOR代谢速率和目标函数(BIOMASS_1)生物质产量之间的关系.据图分析，当酶PFOR的通量值在0～0.000 6 mmol·h-1的范围变化时，目标函数的通量值保持在0.053 9 mmol·h-1不变，即改变酶PFOR的通量值界限，不会对蓝藻的光合生长速率产生影响；当酶PFOR通量值在0.000 6～0.001 2 mmol·h-1的范围变化时，目标函数的通量值保持在0 mmol·h-1不变.由此可知，当酶PFOR的通量值在一定范围内变化时，对蓝藻的光合生长速率没影响(正常生长)，但当酶PFOR的通量超过某一个值后，将会对蓝藻的生长起抑制作用.

综上所述，基因敲除仿真实验是一种实验结果全和无比较强烈的方法，这种方法比较容易使仿真结果产生失真，而多目标优化方法能更好的描述酶PFOR和光合生长速率的关系，使得仿真结果更加符合实际[15].由结果可知，酶PFOR的通量值应在很小范围内变化，这样才更有利于蓝藻的生长，数值大了会对蓝藻的生长起抑制作用.

3 结论

BiGG Models是由美国基于约束的代谢流分析方面的创立者University of California，San Diego的帕尔逊教授研究组开发的专业代谢网络数据库，是相关代谢网络的主要来源.该数据库的最大特点是含有各类模式生物的代谢谱图模型，用户可以直观的调取各种生物的整体代谢通路，也可以查看某个具体的生化反应.目前，BIGG数据库含有2 766个代谢产物和3 311条代谢生化反应，可以对代谢产物进行搜索.所以，BIGG数据库在数据量和可靠性方面都是具有科学性和可使用性的.

蓝藻的代谢系统中敲除酶PFOR后，有多数反应的通量受到了影响[16]，说明酶敲除后，通过代谢物与辅酶的耦连，对离其较远的反应产生了影响.敲除代谢系统中通量值为0 mmol·h-1的酶PFOR后，目标函数通量值保持不变，说明酶PFOR是蓝藻代谢系统中的非必需基因.在FBA方法预测得到的最优解的前提下，通过FVA方法得到酶PFOR的最小通量和最大通量值均为0 mmol·h-1，说明应将代谢系统中酶PFOR的通量值保持在很小范围内，数值大了不利于蓝藻的光合生长.基因敲除仿真是一种全和无的实验方法，通过多目标优化方法能更好地描述酶浓度和生物量之间的关系，在模拟实验中，蓝藻的光合生长速率受酶PFOR浓度的影响，当增加酶的浓度，会不利于蓝藻生长；当酶的浓度降低，光合生长率会得到提高.通过仿真计算的结果与参考文献三中的实验结果比较一致，说明通过仿真能更好的预测和了解代谢系统.

本文利用蓝藻的代谢网络为实验模型，模拟敲除其中的酶PFOR，并利用通量平衡分析、通量可变性分析和多目标优化方法研究基因敲除后的突变型代谢网络.通过仿真实验研究，一方面推测出了酶PFOR对蓝藻光合生长速率的影响，有利于更好地了解酶PFOR的作用；另一方面，这种仿真方法具有一定的效果，对预测和了解代谢系统提供了一个可行方法.对于代谢系统，酶PFOR可能还具有其他未知功能，有待进一步实验去探究.