成 祝，刘 洁，冉 琴，邓 星，罗 蓓，苏小东

（重庆科技学院 化学化工学院，重庆 401331）

发酵食品是指人们利用有益微生物加工制造的一类食品，日常食用的发酵食品主要有谷物发酵制品、豆类发酵制品和乳类发酵制品，其富含氨基酸、多肽、蛋白质、糖类等营养物质，对人体健康有很大的益处[1]。发酵食品因存在多种细菌等，保质期一般较短，为延长食品的保质期，往往会在加工过程中加入一些食品防腐剂。

苯甲酸和山梨酸是最常用的食品防腐剂，但过多食用苯甲酸和山梨酸会影响人体对维生素和钙的吸收，加重人体肝脏负担，并引起毒症反应或诱发癌症[2-3]。因此国家标准[4]对苯甲酸、山梨酸的使用范围与限量做了严格规定。

新近研究发现苯乳酸（phenyllactic acid，PLA）[5]可以有效的防止食物腐败变质，而且对多种食源性致病菌都有很强的抑菌作用[6]，可作为一种广谱的杀菌剂、天然新型防腐剂用于食品防腐保质。同时有研究者[7]发现，苯乳酸与防腐剂联合作用，可以有效的减少食品中人工合成防腐剂的添加量，减少人工防腐剂对人体的危害。天然防腐剂苯乳酸复合其他人工合成防腐剂使用将成为食品防腐的发展趋势。

目前，苯甲酸和山梨酸的检测方法主要包括气相色谱法（gas chromatography，GC）[8-10]、毛细管电泳法（capillary electrophoresis，CE）[11]、高效液相色谱法（high-performance liquid chromatography，HPLC）[12-15]、液相色谱-质谱联用法（liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS）[16]、液相色谱-三重四极杆质谱法（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）[17]、液相色谱-飞行时间质谱法（liquid chromatography-time of flight-mass spectrometry，LCTOF/MS）[18-19]和表面增强拉曼光谱法（surface enhanced raman spectroscopy，SERS）[20]等。但同时检测苯乳酸和其他食品防腐剂还未报道。本研究利用高效液相色谱法（HPLC），通过简单的样品前处理建立了一种同时、简便、快速检测发酵食品中苯乳酸、苯甲酸、山梨酸的高效液相色谱的分析方法，以期将该方法运用于多种发酵食品检测，为苯乳酸与苯甲酸与山梨酸的复配提供技术手段。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1～9号样品：市售；醋酸铵（分析纯）、山梨酸（纯度99%）：上海麦克林生化有限公司；苯甲酸（纯度99%）、三氟乙酸（纯度＞99.5%）：上海源叶生物有限公司；苯乳酸（纯度98%）：阿拉丁控股集团有限公司；乙酸锌（分析纯）、亚铁氰化钾（分析纯）、甲醇（色谱纯）：成都科隆有限公司；磷酸三钠（分析纯）：川东化学集团有限公司；磷酸二氢钠（分析纯）：北京康普惠威科技有限公司。

1.2 仪器与设备

福立LC5090 高效液相色谱色谱仪：浙江福立分析仪器股份有限公司；ATY124分析天平：日本岛津公司；T9紫外可见分光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司；SB-120D超声清洗机：宁波新芝生物科技股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 色谱分析条件

色谱柱：采用SapphiresilTM C18柱（5 μm，4.6 mm×250 mm）；流动相：0.020 mol/L乙酸铵（pH=6.4）-甲醇溶液（80∶20，V/V）；流速：1.0 mL/min；进样量：20 μL；进样方式：满环进样；色谱柱温度：25 ℃，检测器：紫外（ultraviolet，UV）检测器。

1.3.2 样品前处理

（1）含蛋白质的样品

参照王淼等[21]的方法并做修改，准确称取2.5 g样品于25 mL比色管中，分别加入0.25 mol/L亚铁氰化钾溶液和0.50 mol/L乙酸锌溶液各1.0 mL，用10%甲醇-水定容，振荡2.0 min，混匀，取10 mL溶液4 000×g离心5.0 min，取上层清液过0.22 μm聚醚砜滤膜，待上机。

（2）其他样品

准确称取2.5 g样品于25 mL比色管中，用10%甲醇-水定容至10 mL，涡旋振荡2.0 min，混匀，取上层清液过0.22 μm聚醚砜滤膜，待上机。

1.3.3 方法验证

在确定的色谱条件下，以苯乳酸、苯甲酸、山梨酸的质量浓度为横轴（X），峰面积为纵轴（Y），配制质量浓度2.00 mg/L、5.00 mg/L、10.00 mg/L、20.00 mg/L、30.00 mg/L、40.00 mg/L、50.00 mg/L的混合标准溶液并绘制标准曲线，从而评估方法的线性度。将混合标准溶液不断稀释至信噪比S/N=3，以此进样浓度为检出限（limit of detection，LOD），以10倍信噪比对应的浓度为定量下限（LOQ）。以原生醋做加标回收率实验，通过计算回收率考察方法的准确度，以回收率的相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）考察方法的精密度。在原生醋样品中添加混合标准溶液，加标水平分别为5.00 mg/L、10.00 mg/L、20.00 mg/L，每个添加水平平行测定6 次，加标回收率计算公式如下：

式中：Csm表示加标检测值，mg/L；Cm表示样品检测值，mg/L；Cs表示加标量，mg/L。

2 结果与分析

2.1 色谱条件的选择

2.1.1 检测波长

液相色谱配备紫外检测器进行分析测试时，选择分析物的最大吸收波长作为检测波长是不必要的[22]，但待分析物在检测波长下要求有较强的吸收。同时波长选择与流动相有一定的关系，如含甲醇的流动相不能在波长低于210～220 nm检测，这取决于甲醇的浓度[22]。苯乳酸、苯甲酸、山梨酸的紫外吸收光谱图见图1。由图1可知，3种待测物都有紫外吸收，且各组分的最大吸收波长不同，但3种防腐剂在波长220 nm处均有较强紫外吸收，为均衡3种防腐剂的检测灵敏度，选择220 nm作为检测波长。

图1 苯乳酸、苯甲酸及山梨酸的紫外吸收光谱图Fig.1 Ultraviolet absorption spectrum of phenyllactate,benzoic acid and sorbic acid

2.1.2 流动相

实验考察了甲醇-混合磷酸盐（0.010 mol/L NaH2PO4+0.010 mol/L Na2HPO4，pH=6.8）（5∶95，V/V）、甲醇-三氟乙酸（trifluoroacetic acid，TFA）（0.020 mol/L TFA，pH=2.1，氨水调节pH为6.1）（5∶95，V/V）、甲醇-乙酸铵（0.020 mol/L，pH=6.4）（5∶95，V/V）等流动相对分离效果的影响。当使用第1种流动相时，苯乳酸未出峰；使用第2种流动相时，苯甲酸未出峰。前两种流动相未实现苯乳酸、苯甲酸、山梨酸的同时检测。当使用甲醇-乙酸铵（20∶80，V/V）为流动相时，检测灵敏度高，分离度均＞1.5，峰形尖锐。因此，选择流动相为甲醇-0.020 mol/L乙酸铵（20∶80，V/V）。

2.1.3 色谱分离条件

采用C18色谱柱分离，通过单因素法对各种色谱条件进行了优化。甲醇比例增加，会使流动相的极性减小，并能增加溶质分子与溶剂分子之间相互作用的强度[22]。改变流动相中甲醇和乙酸铵溶液的比例，发现随着甲醇比例增加，3种待测物的保留时间变短；在1.0～1.2 mL/min范围内改变流速，22～40 ℃内改变柱温，0.010～0.050 mol/L范围内改变乙酸铵溶液的浓度，4.0～7.0范围内改变乙酸铵溶液的pH值进行条件优化。结果表明，当乙酸铵流动相pH值为6.4，浓度为0.020 mol/L，柱温为25 ℃，流速为1.0 mL/min，检测灵敏度高，3种待测物分离度＞1.5，峰形较好，在12 min内可实现色谱的分离检测，高效液相色谱图见图2。

图2 苯乳酸、苯甲酸及山梨酸混标的高效液相色谱Fig.2 HPLC chromatography of mixed standards of phenyllactate,benzoic acid and sorbic acid

2.2 滤膜的选择

实验考察了水系滤膜与有机系滤膜对苯乳酸、苯甲酸和山梨酸的影响。以10.00 mg/L的混合标样作为待过滤液，分别用0.22 μm聚醚砜滤膜、0.22 μm尼龙滤膜过滤后上机检测，检测结果见图3。由图3可知，尼龙滤膜的回收率在105.00%～110.00%，而聚醚砜滤膜的回收率在100.00%～105.00%，准确度更高。因此，选择0.22 μm聚醚砜滤膜进行样品过滤。

图3 不同滤膜对回收率的影响Fig.3 Effect of different membranes on recovery

2.3 方法的线性范围、检出限及定量限

由表1可知，在优化条件下，苯甲酸线性范围为0.010～50.00 mg/L，苯乳酸为0.075～50.00 mg/L，山梨酸为0.050～50.00 mg/L，且相关系数R2均≥0.998，检出限在0.010～0.050 mg/L，定量限在0.025～0.25 mg/L，表明该方法提供具有宽线性范围的灵敏检测。

表1 三种防腐剂分析的线性范围、相关系数、回归方程、检出限及定量限Table 1 Linear range,correlation coefficient,regression equation,detection limit and quantitation limit of three kinds of preservatives

2.4 样品加标回收率试验

为了验证方法的准确性，本研究选取7号样品（某原生醋）作为加标回收试验。分别向样品中加入5.00 mg/L、10.00 mg/L、20.00 mg/L不同质量浓度的苯乳酸、苯甲酸、山梨酸的混合标样，混匀，经过样品前处理后测定其回收率。每个添加水平平行测定6次，其结果见表2。

表2 加标回收率试验结果Table 2 Results of adding standard recovery tests

由表2可知，该方法的回收率为96.93%～118.42%，精密度实验结果相对标准偏差（RSD）为0.93%～6.21%，说明方法的准确度和精密度较高，此方法的精密度和准确度符合实际样品的检测要求。

2.5 样品中防腐剂的检测

应用所建立的方法对市售的几种样品进行检测，检测结果见表3。该检测结果对比GB7718—94《食品标签通用标准》[23]，样品（1～3，7～8号）存在检出与样品标签不符的情况，但对比国标GB 2760—2014《食品添加剂使用标准》[4]，样品中苯甲酸与山梨酸检出值均未超过添加限（1.00 g/kg）。其中1～3号样品有包装袋上未标注的苯甲酸检出，7～8号样品有包装袋上未标注的苯甲酸、山梨酸检出。

表3 发酵食品样品中三种防腐剂检测结果Table 3 Determination results of three kinds of preservatives in fermented food samples

由表3可知，发酵食品样品里都含有不同程度的防腐剂，一般都含有天然的防腐剂——苯乳酸。据文献报道，某些食品在发酵过程中会自身产生苯甲酸（内源性苯甲酸），故不能确定检出的苯甲酸是否为外源性苯甲酸，但山梨酸应属于人为添加。

3 结论

本实验建立了HPLC快速检测食品中苯乳酸、苯甲酸、山梨酸，以分析标准品与样品的保留时间对应定性。在优化的色谱条件下，3种防腐剂在12 min之内完成分离检测，检出限在0.010～0.050 mg/L之间，定量限在0.025～0.25 mg/L，回收率为96.93%～118.42%，精密度实验结果相对标准偏差为0.39%～6.21%。该方法检测速度快、所需设备简单、无需复杂的样品前处理。