杨 行，张 明，阿依帕夏·热合曼，郭丽君，王 莉，王玉涛

（1.喀什大学 生命与地理科学学院叶尔羌绿洲生态与生物资源研究高校重点实验室，新疆 喀什 844000；2.新疆玉昆仑天然食品工程有限公司，新疆 喀什 844000）

驴乳作为一种天然的食品资源，是低脂肪、低胆固醇的食品[1-2]，具有降低血脂血压、软化血管、抑制结核杆菌的作用[3-4]，具有抗菌抑菌[5]、抗癌抑癌[6]、消炎止痛[4]、抗疲劳、抗氧化等功效[7]，而驴乳蛋白属于优质蛋白，包含多种生物活性成分，促进消化和吸收，增强人体免疫力，因此驴乳不仅具有较高的营养价值，更具有广泛的药用价值，因其独特的成分，自古以来就被作为滋补营养品，也是治疗和预防多种疾病的食疗佳品[8-9]。酸奶是指乳在发酵剂（特定菌）的作用下发酵而成的乳制品，酸奶营养丰富、风味独特、易于消化吸收，是一种能提高人体免疫力、降低胆固醇、预防心脑血管疾病、调节肠道菌群平衡、有效缓解乳糖不耐症的健康食品，近年来驴乳酸奶成为研究和开发利用的热点，受到乳品、食品界的普遍关注[10-11]。

关于驴乳酸奶的开发研究，CHIAVARI C等[12]使用鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus）和干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）发酵驴乳，制成发酵驴乳饮料；彭珊珊等[13]研究发现，鼠李糖乳杆菌（L.rhamnosus）、罗伊乳杆菌（Lactobacillus reuteri）等6株乳酸菌均可使驴乳凝乳，其中罗伊乳杆菌（L.reuteri）和植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）凝乳最快；PERNA A等[14]使用嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）、干酪乳杆菌（L.casei）发酵驴乳，生产出一种功能型的发酵饮料；TURCHI B等[15]以植物乳杆菌（L.plantarum）和嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）为发酵剂制作驴乳发酵饮料；MARIA M等[16]研究发现干酪乳杆菌（L.casei）、鼠李糖乳杆菌（L.rhamnosus）都能成功发酵驴乳。这些都有助于开发一种具有抗高血压、抗菌、抗氧化性的功能型发酵驴乳制品。由于驴乳乳清蛋白含量高、酪蛋白含量低，相对牛羊乳发酵不容易凝乳，所以大部分研究都以乳酸菌发酵驴乳制成功能性发酵饮料。本研究在发酵驴乳时加入一定比例的全脂中乳粉，制成凝固型的风味驴乳酸奶，采用单因素试验响应面法对风味驴乳酸奶的生产工艺进行优化，得出风味驴乳酸奶的最佳生产工艺，为风味驴乳酸奶的生产制作提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

全脂牛乳粉：新疆南达乳业有限公司；鲜驴乳（含水量90.59%，全乳固体9.41%，其中蛋白质1.60%、脂肪1.04%、乳糖6.34%、灰分0.39%[2]）、蔗糖：市售；乳酸菌：北京多爱特生物科技有限公司；MRS培养基、结晶紫中性红胆盐琼脂：北京奥博星生物技术有限责任公司；无水乙醇、氢氧化钠、氯化钠、酚酞（均为分析纯）天津致远化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

YP6002电子天平：余姚市金诺天平仪器有限公司；LD2X-50KBSS立式压力蒸汽灭菌锅：上海申安医疗器械厂；DHP-500型电热恒温培养箱：北京市永光明医疗仪器有限公司；BCD-205HK电冰箱：海信科龙电器股份有限公司；PHS-3C pH计：上海雷磁仪器厂；SW-CS-2F净化工作台：苏州安泰空气技术有限公司；NDJ-5S黏度计：浙江力辰仪器科技有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 风味驴乳酸奶加工工艺流程[17]

鲜驴乳＋全脂中乳粉＋水→预热→添加蔗糖→高温杀菌→冷却→添加发酵剂→混匀后装瓶→发酵→冷却至室温→后熟→检验→成品

操作要点：用45 ℃左右的温水将一定量的全脂牛乳粉、鲜驴乳溶解混匀，预热后添加一定比例的蔗糖，搅拌溶解；95 ℃水浴加热5 min进行灭菌，迅速冷却至45 ℃，接种发酵剂是保加利亚乳杆菌（Lactobacillus bulgaricus）和嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）为1∶1的冻干乳酸菌粉，接种量为0.04 g/kg，无需活化可直接投放；接种完毕混合均匀，灌装至经过灭菌（121 ℃、20 min）的玻璃瓶中于42 ℃条件下静置发酵5～6 h；凝乳状态均匀、滴定酸度达到80～90°T后，发酵结束；将酸奶放入4℃冰箱冷藏24 h后熟，得到风味驴乳酸奶。

1.3.2 发酵工艺优化单因素试验

固定发酵温度42 ℃、发酵时间6 h的条件下考察牛乳粉添加量分别为8%、9%、10%、11%、12%对酸奶品质的影响；固定牛乳粉添加10%、发酵时间6 h的条件下考察发酵温度分别为40 ℃、41 ℃、42 ℃、43 ℃、44 ℃对酸奶品质的影响；固定牛乳粉添加10%、发酵温度42 ℃的条件下考察发酵时间分别为5.0 h、5.5 h、6.0 h、6.5 h、7.0 h对酸奶品质的影响。

1.3.3 发酵工艺优化响应面试验

在单因素试验的基础上，选择牛乳粉添加量（A）、发酵温度（B）、发酵时间（C）为自变量，以感官评价（Y）为因变量，利用Design-Expert 8.0.6软件，进行Box-Behnken试验设计[18]，响应面试验设计因素与水平见表1。

表1 Box-Behnken试验设计因素与水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken tests design

1.3.4 风味驴乳酸奶各项指标测定

（1）感官评价

由食品专业的学生及食品企业工作人员，采用百分制评分方法，对每一次发酵成熟的风味驴乳酸奶在室温条件下放置15 min再进行品尝评分，避免较凉的温度影响口感。感官评分标准见表2。

第一，完善安装工艺结构，施工部门要从精细化施工结构出发，确保具体质量操作管理工序的完整性，有效分析整体质量要求的基础上，就要尽量对温度进行控制管理，以保证能减少漏焊和跳焊问题等，按照功能要求对结构独特性予以认知，从而完善设计效率，也为工程项目安全性提供保障[6]。

（2）理化指标

pH的测定采用pH计直接测定；总酸度的测定：参照国标GB 5413.34—2010《乳和乳制品酸度的测定》中的滴定酸度法进行测定[19]，采用滴定酸度法，用吉尔涅尔度（°T）表示；持水力的测定：参考相关文献[20]，取酸奶10 g，室温条件下5 000 r/min离心30 min，弃上清液，离心管倒置10 min后立即称质量，计算持水力（持水力=离心沉淀物质量/样品质量×100%）。

黏度测定：使用黏度计，选用3号转子和12 r/min的转速，计时1 min后读取数值[20]。测定三组平行，取平均值。

（3）微生物指标

乳酸菌数测定：参照国标GB 4789.35—2016《食品安全国家标准食品微生物学检验乳酸菌检验》进行测定[21]，将酸奶稀释成10-5、10-6、10-7的稀释液，取1 mL稀释液均匀涂布于MRS平板培养基上，每个稀释度做2个重复，（36±1）℃培养48 h后计数平板上所有菌落数。大肠杆菌测定：参照GB 4789.3—2016《食品安全国家标准食品微生物学检验大肠菌群计数》进行测定[22]，将酸奶稀释成10-1、10-2的稀释液，取1 mL稀释液均匀涂布于结晶紫中性红胆盐琼脂培养基上，每个稀释度做2个重复，（36±1）℃培养24 h后计数平板上所有菌落数。

1.3.5 数据统计与分析

数据以“平均值±标准差”表示，使用Excel 2007进行统计整理，用SPSS Statistics 23.0软件进行方差分析，用Origin、GraphPad软件进行制图，用Design-Expert 8.0.6进行响应面及数据分析。

2 结果与分析

2.1 风味驴乳酸奶发酵工艺优化单因素试验结果与分析

由表3可知，牛乳粉添加量对风味驴乳酸奶品质影响较大，随着牛乳粉添加量逐渐增大，酸奶pH值逐渐下降，其他的各项理化指标均呈现上升状态。当牛乳粉添加量为8%～10%时，酸奶组织不均匀，状态较为稀松；当牛乳粉添加量为10%时，酸奶组织均匀，流动性好，牛乳味、驴乳味香气平衡，感官评分最高，为88.75分；当牛乳粉添加量＞10%时，酸奶黏度上升，口感上也太黏稠，已品尝不出驴乳的香甜味，感官评分下降显著。因此，选择牛乳粉添加量为10%。

表3 牛乳粉添加量对风味驴乳酸奶品质的影响Table 3 Effect of cow milk powder addition on the quality of yoghurt with donkey milk flavor

2.1.2 发酵温度对风味驴乳酸奶品质的影响

由表4可知，较低温度发酵酸奶感官品质较差，组织松散，酸度较低，凝乳状态不佳，酸奶的香气奶味不足；随着发酵温度的上升，酸奶的品质与感官评分都有所上升，在发酵温42 ℃左右时达到感官评分峰值，为88.50分，此时酸奶组织结构均匀，酸甜适中，有浓郁的驴乳香甜味；之后随发酵温度继续上升，感官评分有所下降，酸奶酸度、黏度有所上升，并有乳清析出，影响了口感。因此，选择发酵温度为42 ℃。

表4 发酵温度对风味驴乳酸奶品质的影响Table 4 Effect of fermentation temperature on the quality of yoghurt with donkey milk flavor

2.1.3 发酵时间对风味驴乳酸奶品质的影响

由表5可知，随着发酵时间的延长，风味驴乳酸奶的感官评分呈现先增大后减小的趋势。发酵时间为5.0 h时，酸奶凝固状态松散，口感稀薄，香味不明显；发酵至5.5时，酸奶的凝固性大幅度提升，酸度也有所增加，酸奶中的香气明显，感官评分在5.5 h达到最高，为89.0分；当发酵时间＞6.0 h以后，酸奶酸味上升，并有乳清析出的现象，口感略显粗糙，感官评分随之下降。因此，选择发酵时间为5.5 h。

表5 发酵时间对风味驴乳酸奶品质的影响Table 5 Effect of fermentation time on the quality of yoghurt with donkey milk flavor

2.2 风味驴乳酸奶发酵工艺优化响应面试验结果与分析

在单因素试验的基础上，选择牛乳粉添加量（A）、发酵温度（B）、发酵时间（C）为自变量，以感官评价（Y）为因变量，利用Design-Expert 8.0.6软件，进行Box-Behnken试验设计[18]，响应面优化试验设计方案及结果见表6，方差分析结果见表7。

利用Design-Expert 8.0.6软件对表6数据进行二次多元回归拟合，得到模型的二次多项回归方程：Y=90.80-0.75A+0.88B+0.38C+0.50AB-1.0AC-1.75BC-6.53A2-6.77B2-5.77C2。

由表7可知，试验选用的模型P＜0.000 1，极显著，失拟项P=0.177 6＞0.1，不显著，表明模型在本实验中的拟合度良好；回归决定系数R2=0.986 0、校正决定系数R2Adj=0.968 0，说明模型拟合度良好，试验误差小，该模型能解释96.8%响应值的变化；变异系数（coefficient of variation，CV）为1.35%＜5%，表明方程有良好的重现性。信噪比为18.345，远大于4，说明模型可信度较高，可以用于风味驴乳酸奶发酵工艺参数的优化。二次项A2、B2、C2对结果影响极显著（P＜0.05）。

表6 Box-Behnken试验设计及结果Table 6 Design and results of Box-Behnken tests

表7 回归模型方差分析Table 7 Variance analysis of regression model

响应面分析图是由响应值和各试验因子构成的立体曲面图，显示了A、B、C中任意一个变量取零水平时，其余两个变量对感官评分的影响。响应面图坡度越大，该因素对感官的影响也越大，但两个因素存在交互作用时，一个因素在另一个因素的不同水平对感官的影响过程有差异[23]。由图1可知，本次研究响应面图均呈现开口向下的钟罩形，即随着因素水平的增加，感官呈现先增加后下降的趋势。等高线图是曲面上相同的响应值在底面上形成的曲线，等高线越趋近于正圆，说明两者的交互作用越小，AB、AC、BC等高线越趋近于椭圆，说明两者的交互作用越大，等高线的密集程度反映了该因素对感官的影响程度，等高线越密集，对感官品质影响越大。

图1 乳粉添加量、发酵温度及发酵时间交互作用对风味驴乳酸奶感官品质影响的响应面及等高线Fig.1 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between cow milk powder addition,fermentation temperature and time on sensory evaluation quality of yogurt with donkey milk flavor

2.3 最佳工艺条件的预测和验证试验

利用Design-Expert 8.0.6对风味驴乳酸奶的发酵工艺参数进行预测，当牛乳粉添加量为9.94%、发酵温度为42.06 ℃、发酵时间为5.51 h时，感官评分预测值为90.85分。为了方便实际操作，将发酵工艺修正为牛乳粉添加量10%、发酵温度42.0 ℃、发酵时间5.5 h，在此条件下进行3次平行验证试验，风味驴乳酸奶呈乳白色、组织均匀、无分层、无乳清析出，口感酸甜适中、顺滑细腻；风味协调、有驴乳特有的香气和乳香味，感官评分实际值为92分，与预测值90.85分极为接近，说明响应面优化的结果是可靠的，具有实际应用价值。

3 结论

本试验通过单因素试验和响应面优化法优化风味驴乳酸奶发酵工艺。结果表明，以牛乳粉添加量、发酵温度和发酵时间为自变量，响应面法优化得出风味驴乳酸奶的最佳发酵工艺为牛乳粉添加量10%，发酵温度42 ℃，发酵时间5.5 h。在此优化条件下，生产出的风味驴乳酸奶口感细腻爽滑，酸甜适口，有浓郁的驴乳香味与滋味，无异味。实测感官评分达到92分，与预测值90.85分基本相符。此结果可充分验证该试验模型的可靠性。风味驴乳酸奶酸度为86 °T，乳酸菌数为9.7×107CFU/mL，其品质完全符合国家发酵乳的标准[24]。