潘禹，王华生，詹鸿峰，孙缓缓

（江西理工大学建筑与测绘工程学院，江西赣州341000）

引 言

受生产活动与气候变化影响，有害蓝藻水华在全球富营养化水体中频繁暴发。藻类过度生长并持续向周围环境释放蓝藻毒素对水生态系统与公众健康构成严重威胁。微囊藻毒素（microcystins,MCs）是自然环境中检出频率最高的蓝藻毒素，具有遗传毒性与肝毒性[1-2]。通过抑制丝氨酸/苏氨酸特异性蛋白磷酸酶（protein phosphatases, PPs）PP1 和PP2A 活性，MCs 可引发一系列细胞代谢事件，如蛋白质过度磷酸化和细胞骨架失稳，从而导致肝脏坏死、出血和功能障碍[2-3]。长期接触或饮用受MCs 污染的水将损害DNA 修复系统[3]，并影响调节细胞分化、增殖和促肿瘤蛋白的表达活性[1-3]。此外，MCs可在生物体内产生活性氧以诱导细胞发生氧化应激，从而导致脂质过氧化增加、线粒体损伤、抗氧化系统破坏和基因组改变[1,4-5]。

环状结构使MCs 的化学性质高度稳定，对常见的蛋白酶与氧化剂具有抗性[6-7]，传统水处理工艺难以有效去除。然而，大量研究证实MCs 可被某些特殊细菌降解[6-11]。微囊藻毒素降解酶（microcystinase或MlrA）是从MCs 降解菌株中鉴定的内肽酶，参与至少两种蓝藻毒素MC-LR和MC-RR的生物降解途径。本文将综述MlrA 的进化关系、物化特征、分子结构与催化机理以及相应的研究进展，以期为解决MCs污染和饮用水安全问题提供参考。

1 MlrA的进化关系

1.1 MlrA的鉴定

1994 年，Jones 等[12]首次从澳大利亚水体中分离表征出一株鞘氨醇单胞菌（Sphingomonas sp. ACM-3962），该菌能够利用MC-LR 作为生长的唯一氮源和碳源，且其无细胞提取物（cell-free extract,CE）可直接催化降解MC-LR[13]。Bourne 等[13]对降解产物的结构进行测定后，提出该菌降解MC-LR至少涉及三种胞内水解酶：(1)MlrA 负责水解Arg-Adda 肽键产生线性产物（NH2-Adda-Glu-Mdha-Ala-Leu-Masp-Arg-OH）；(2)线性MC-LR在Ala-Leu肽键处被MlrB水解，形成四肽中间体（NH2-Adda-Glu-Mdha-Ala-OH）；(3) MlrC 水解Adda-Glu 肽键以生成最终产物Adda。

随后，鉴定了与酶促途径相关的mlr 基因簇（mlr A～D），且mlrA 基因与MlrA 的表达直接相关[14]。因此，已将mlrA 作为基因分子标记，设计特定引物通过聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）扩增检测mlrA 基因，用于鉴别分离物中MCs的降解机制[6,15]。

1.2 MlrA的同源性

MlrA 的直系同源物散落分布于全球各地的水生态系统中。目前，已分离出多株携带mlrA 基因（mlrA+）的细菌，主要包括属于α 变形菌门的鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas spp.）[11-12,16-18]、鞘氨醇胞菌属（Sphingosinicella spp.）[16,19]、新 鞘 氨 醇 菌 属（Novosphingobium spp.）[20]、根 瘤 菌 属（Rhizobium spp.）[15]、鞘氨醇盒菌属（Sphingopyxis spp.）[18,21-22]，以及β 变形菌博德特氏菌属（Bordetella spp.）[23]与γ 变形菌寡养单胞菌属（Stenotrophomonas spp.）[24]。

Genbank 数据库中公开储存了数十种不同细菌来源的非冗余MlrA 酶氨基酸序列。相似性搜索（BLASTp）和多重序列比对表明，MlrA 在mlrA+菌株中高度保守，序列相似性达到92%～100%。但由于缺乏α 变形菌以外的序列数据，对其进化关系的理解十分有限。MlrA 编码基因虽在各类菌株中呈现出较高同一性，但观察到mlrA+菌株全基因组中GC（鸟嘌呤与胞嘧啶）含量[58.4%～59.2%（mol）]略低于相关属内细菌[58.9%～68%（mol）][15]。这表明mlrA基因并不是某种细菌特有，而是通过水平基因转移得来，并伴随α 变形菌进行垂直进化，使DNA 密度发生变化[15]。系统发育分析结果与上述结论一致，在MlrA 序列与16S rDNA 序列进化树中，分类相近物种占据相似发育位置，彼此紧密聚集[15,22]。然而，β与γ 变形菌的MlrA 序列并未像16S rDNA 一样在进化树中形成明显分支，反而对鞘氨醇盒菌属内细菌显示出明显亲和力。该发现表明mlrA 基因可能在进化中再次发生了侧向基因转移，使α 变形菌以外的菌株获得了遗传信息[15,22]。

此外，MlrA 与Ras 和α 因子转换酶（Rce1）适度同源。CAAX（C 为半胱氨酸，A 为脂肪族氨基酸，X为任意氨基酸）是一种来源丰富的真核蛋白，在细胞信号传导过程中具有重要作用，参与细胞的增殖、分化以及癌变等过程[25]。Rce1 为膜内切蛋白酶，定位于内质网，负责切割CAAX 蛋白羧基端-AAX 三肽用以协调该蛋白在细胞膜上的正确定位[26]。更广泛的序列相似性搜索推断，MlrA是CPBP（CAAX proteases and bacteriocin-processing enzymes,CAAX 蛋白酶和细菌素加工酶）家族成员，该家族对应于蛋白质家族数据库（Pfam）中的Abi（abortive infection，流感感染）家族（也称为CAAX 氨基末端蛋白酶家族）[27]。

2 MlrA活性调控与底物特异性

2.1 表达与调控

通常，在对数生长后期收集mlrA+细菌培养物，经超声破菌后将上清液（即CE）用于随后的酶促分析。由于无法避免杂质蛋白干扰，MlrA 的异源表达成为关注重点。通过将mlrA 克隆至sCos-1，pBSK II SK，pGEM5Xf(1)或pGEX-4T-1载体，MlrA可实现在大肠杆菌宿主中的异源表达[14,28-30]。Dziga 等[29]首次尝试将表达MlrA 的大肠杆菌细胞固定在藻酸盐凝胶珠中，在湖水连续流中使MC-LR的去除率达到80%以上。虽然MlrA 在大肠杆菌内无法保持长期稳定（活性＜4 d）[29-30]，但其表达量高，降解能力远远高于野生菌株[14,29]。近期，Dexter 等[30]成功在蓝藻Synechocystis sp.PCC 6803中异源表达MlrA 酶，并观察到MlrA 在蓝藻宿主中稳定性明显提升，在9 d 的长期培养中仍具有活性。该研究可为MCs 原位降解提供理论基础。

MlrA 活性的调控强烈依赖于底物浓度。通常情况下，分离表征的mlrA+细菌在MCs作为营养来源时存在降解滞后期（10 h～2 d）[12,23]。目前研究普遍认为MCs 为胞外信号分子，可诱导MlrA 进行表达[31-32]。通 过 实 时 逆 转 录PCR 研 究，Jiang 等[20]发 现当MCs 降解菌Novosphingobium sp. THN1 暴露于微量浓度的MC-LR 时，mlrA 基因的表达显著上调，且暴露浓度越高mlrA的转录越快速。Hoefel等[33]与Ho等[34]设计了一种实时定量PCR 测定法，用于检测砂滤器生物膜内的mlrA 基因与废水处理过程中mlrA+细菌的丰度。两项研究均表明，MC-LR 是mlrA+细菌增殖的主要底物，当环境中存在MC-LR 时，mlrA基因拷贝数将快速增长。

此外，Li 等[35]发现mlrA 基因的表达受到营养元素限制。与无营养条件相比，添加氮或磷可刺激mlrA基因表达量，使生物降解速率发生改变。

2.2 底物特异性

MlrA 的底物特异性存在争议。Dziga 等[28]通过底物筛选，发现MlrA 对28 种荧光合成底物和32 种显色合成底物均无活性，这表明MlrA 特异性极强，其作用范围仅限于蓝藻毒素。MCs的化学结构如图1 所示。 Imanishi 等[17]比较了鞘氨醇单胞菌Sphingomonas sp.B-9对8种MCs类似物和蓝藻五肽毒素节球藻素（nodularin, NOD）的降解能力。结果表明，B-9 菌可降解含有Arg-Adda 肽键的MCs 类似物和NOD，且1 和2 位置氨基酸的取代、缺失或7 位置Mdha残基的修饰对MlrA活性无影响。相反，对6(Z)-MC-LR 和6(Z)-MC-RR（由6(Z)-Adda 取代Adda组成的几何异构体，含Arg-6(Z) Adda 肽键）或MCLF（含Phe-Adda 肽键）不具备降解活性。因此，推断MlrA 对底物具有结构相对专一性，识别肽序MeAsp-Arg-Adda 并选择性水解Arg-Adda 肽键[17]。该结论在后续研究中得到验证。Yang 等[23]发现当Stenotrophomonas sp. LTH1 菌 株 暴 露 在MC-LR 与MC-RR 共存环境时，其对底物的降解速率分别由0.31 mg·(L·h)-1和0.17 mg·(L·h)-1下降至0.27 mg·(L·h)-1和0.12 mg·(L·h)-1。这表明MC-LR 和MCRR 降解途径类似，多种底物在MlrA 催化时形成酶竞争。此外，MlrA 对含有MeAsp-Arg-Adda 肽序结构的MC-RR 和MC-YR 同样具有降解活性，且降解途径通常与MC-LR相似[16,19]。

图1 MCs的化学结构式Fig.1 General chemical structure of MCs

然而，部分文献报道与之矛盾：Sphingomonas sp. ACM-3962[12]和Sphingomonas sp. MD-1[16]无法降解NOD，但ACM-3962菌株表达的MlrA 可分别通过攻 击Adda-Phe 和Adda-Trp 键 使MC-LF 和MC-LW线性化[28]。上述差异表明NOD 可能不是MlrA 的识别底物，在某些MCs 降解菌（如B-9）中存在未知的功能基因与酶促解途径。该假设随研究深入愈发引起关注，已确定部分mlrA+细菌对MeAsp-Arg-Adda 肽序之外的MCs 仍具有催化作用，如Sphingopyxis sp. TT25 可降解MC-LA[36]，Sphingopyxis sp.MB-E可降解MC-LF、MC-LY和MC-LW[37]。

2.3 抑制特性

MlrA 的酶活性不受一般肽酶抑制剂影响，如苯甲脒（蛋白水解酶抑制剂）、苯甲基磺酰氟（丝氨酸蛋白酶抑制剂）、亮抑酶肽（丝氨酸/半胱氨酸肽酶抑制剂）、E-64（半胱氨酸肽酶抑制剂）、胃酶抑素（天冬氨酸蛋白酶抑制剂）和大豆胰蛋白酶抑制剂（胰蛋白酶与丝氨酸蛋白酶抑制剂）[14]。然而，在EDTA及1,10-邻菲咯啉的孵育下，MlrA 酶活性急剧下降，表明该酶可能是金属肽酶[14,28]。纯化MlrA 酶的抑制研究表明，1,10-邻菲咯啉较EDTA 抑制性更强，IC50值（半抑制浓度）分别为(1.48±0.31) mmol·L-1和(37.6±3.1)mmol·L-1[28]。

MlrA 为中性蛋白酶，在pH 为6.4～9.4 时活性较高，最佳反应pH 为7.6。纯化MlrA 对碱性条件具有一定耐受性，当pH 升高至10.0 时，相对活性略低于50%[28]。Okano 等[18]研究结果也表明Sphingopyxis sp.C-1 中MlrA 的活性在pH 为6.52～8.45 时最佳，在碱性条件下亦具催化活性。这可能与mlrA+细菌受到自然环境驯化有关。由于蓝藻生长期间光合作用不断增强，水体pH 在蓝藻暴发时易于发生变化并逐渐变为碱性[32]，这促使mlrA+细菌在进化过程中对碱性环境保持耐受性。MlrA 在酸性条件下难以保持稳定，当pH=5.0 时，观察到其相对活性仅为25%[28]。此外，MlrA 的催化速率还取决于温度，最佳反应温度为25～35℃[15,19,23-24]。

3 MlrA的拓扑与结构

3.1 定位与拓扑

MlrA 在细胞中的位置还未明确。前期研究假设MlrA 为胞内酶[12]，但后续分析中未检测到负责将MCs 导入细胞的转运蛋白。其次，SignalP 分析预测该酶N 端含有约26 个残基组成的信号肽序列[13-15]，提出MlrA 通过引导作用被递送至细胞周质空间。然而，Dziga等[28]发现去除信号肽序列的MlrA人工构建体的完整细胞也可以降解少量MC-LR，其降解能力约为CE 的1/440。作为对比，野生菌株细胞体酶活力仅约为CE 的1/30。上述数据分析可知，MlrA在鞘氨醇单胞菌与大肠杆菌宿主内因翻译加工机制不同，性质可能发生改变。

从同源性上分析，与Rce1序列相似更倾向于将MlrA 归类为膜蛋白。此外，通过亚细胞定位预测该酶位于细胞质膜[38]，且计算分析显示该酶具有多个跨膜区[39]。二级结构预测MlrA 主要由α-螺旋和loop 结构组成，很少或没有β-折叠[40]。这些信息与跨膜蛋白的结构类型相吻合。但由于缺乏蛋白质标签或氨基酸标记验证，MlrA 蛋白酶N 端与C 端的投射位置仍不确定。

图2 不同菌株来源MlrA酶的氨基酸序列比对Fig.2 Sequence alignment of MlrA from different strains

3.2 活性位点

根据DNA 翻译结果，完整MlrA 序列含有336个残基，计算分子量约为36×103。根据图2 序列对比图，所有MlrA氨基酸序列都含有HxxHxE基序，该基序可能是金属肽酶中锌结合基序（如HExxH）的变体。Bourne 等[14]推断HxxHxE 基序中组氨酸残基（H260和H263）和谷氨酸残基（E265）为二价金属阳离子结合配体。随后，Dziga 等[28]通过定点突变构建点突变体MlrAH260A 和MlrAE265A，两种突变体均无活性证实该基序为MlrA的活性中心。

MlrA 还含有两个CPBP 家族成员共有的假定功能基序（图2）[27]。在这些基序中，谷氨酸和组氨酸残基（E172、E173、H205 和H260）高度保守。已验证MlrAE172A 和MlrAH205A 突变体丧失活性[41]，但根据CPBP 家族蛋白实验数据分析，上述其他保守残基仍可能与底物催化有关[27,42-43]。

3.3 分子结构

由于PDB 数据库中缺少与MlrA 高度相似的蛋白质晶体结构，关于MlrA 的结构信息所知甚少。通过NCBI CD-search 分析，MlrA 序列下游存在Abi结构域。MmRce1（PDB ID：4CAD）是唯一与MlrA具有一定同源性（同一性≤20%）的已解析结构蛋白，其序列中同样含有Abi 结构域，结构如图3（a）所示[44]。

最近，Xu 等[41]通过Phyre2 服务器根据4CAD 的晶体结构构建了MlrA 的三维结构模型，该模型结构类似于图3（b）（由I-TASSER 模拟）。对于膜蛋白而言，同源物之间跨膜区段（主要由疏水氨基酸组成）的序列差异是普遍现象。因此，尽管MlrA 与MmRce1 之间序列同源性较低，但其晶体结构相似，催化残基高度保守。MlrA 由8个跨膜螺旋（TM1～8）组成，与4CAD对齐的Abi结构域位于TM4～TM7中，其余4个螺旋将Abi结构域包围，并一同形成容纳底物的锥形反应腔。保守残基E172、H205、H260 和N264 位于跨膜螺旋内，并且其侧链投射至腔体内部，直接参与催化反应。

4 MlrA的水解机制

前期研究在菌株培养时添加外源金属离子，研究了MlrA 的活化机制，推断MlrA 为基质金属蛋白酶。吴涓等[45]发现吉氏库特菌M9 分别在Cu2+、Zn2+和Mn2+（1 mg·L-1）的促进作用下，对MCLR 与MC-RR 的降解活性显著提高。然而，周洁等[46]却发现同样浓度的Cu2+、Zn2+和Mn2+对食酸戴尔福特茵USTB04 降解MCs 无明显作用，其中Cu2+还具有一定的抑制作用。Ho 等[47]同样发现0.5 mg·L-1的Cu2+抑制菌株Sphingopyxis sp. TT25 降解MCs。这些数据表明，某些金属离子可能是MCs生物降解过程中的辅助因子，与体系内降解菌株丰度和生物相互作用有关[48]，而对MlrA 的活性无直接关联。

图3 MmRce1（a）与MlrA（b）的分子结构Fig.3 Three dimensional structure of MmRce1(a)and MlrA(b)

随研究深入，发现MlrA 序列中存在一组高度保守的谷氨酸与组氨酸，且其活性受1,10-邻菲咯啉与EDTA 影响，因此推定该酶为锌结合蛋白酶（如3.3节所述）[14,25,29]。但X 射线晶体学研究表明，与MlrA结构同源的MmRce1 晶体中不存在结合Zn2+；1,10-邻菲咯啉使该酶失活是由于蛋白结构解折叠，并不是螯合了酶中的Zn2+[44]。最近，Xu 等[41]通过分子动力学模拟还发现HxxHxE 基序中假定金属结合残基Glu与配体Zn2+间隔距离较大，形成的结合网络并不完整。因此，MlrA的活性可能不需要Zn2+激活，其水解机制与4 种已建立的典型蛋白水解机制（天冬氨酸，半胱氨酸，丝氨酸/苏氨酸和金属基）不同，而与MmRce1相似。

MlrA 的模拟分子结构显示了一种新蛋白质水解机制，其活性位点包括谷氨酸、两种组氨酸和对催化活性必不可少的天冬酰胺。图4 为MlrA 催化位点信息。在底物催化过程中，两个对应跨膜螺旋（TM4 与TM5）中 的E172 与H205 残 基 最 为 关 键。E172 与H205 通过水分子作为配体彼此桥接，并将水分子通过碱催化（base catalysis）去质子化激活，对底物易断裂羰基键进行亲核攻击（nucleophile attack）。而H260和N264侧链位于TM7的连续螺旋转角上，与催化二连体E172和H205相对应，提供氢键以稳定形成的四面体氧阴离子过渡态（oxyanion transition state）。而后，该中间体塌缩为羧酸盐，将H205 或E172 质子转移所促成的胺丢弃，起到氧阴离子孔（oxyanion hole）的作用。此外，W176和W201残基与E172的羧酸侧链相接触，以提高其pKa，加快化学反应的速率[41,44]。尽管上述蛋白水解机制是新颖的，但在其他膜相关蛋白酶中同样发现所涉及的催化元素。例如锌金属蛋白酶S2P[49]与Ste24[50-51]、真菌谷氨酸肽酶SGP[52]和菱形蛋白酶GlpG[53-56]都具有类似作用：使用谷氨酸/丝氨酸活化水分子并由Asn 和His 残基形成氧阴离子孔。晶体结构模型为深入了解MlrA 的结构提供了理论基础，但由于初级结构和拓扑结构的物种特异性差异，对其水解机制的进一步研究应保持谨慎。根据Clustal Omega 分 析[57]，MmRce1 与MlrA 的 一 级 结 构 仅 有17%～20% 的同源性，序列覆盖率为74%～83%；MmRce1 作为真核膜蛋白定位于内质网（endoplasmic reticulum,ER），而MlrA 为原核生物表达，设想其定位于质膜，其N 端与C 端投射位置尚不明确。解决MlrA 的晶体结构将有助于更好地理解蛋白酶水解催化机制。

图4 MlrA的催化位点Fig.4 Crystal structure of MlrA catalytic site

5 结 论

近年来，水体富营养化现象不断加剧，蓝藻水华污染形势日益严峻。根据联合国儿童基金会（UNICEF）与世界卫生组织（WHO）联合发布的2000—2017 饮用水与环境卫生监测规划报告，全球约三分之一的人无法通过基本水处理设施获得安全饮用水[58]。作为环境友好型策略，MCs 的微生物降解已研究近30 年，虽然在mlrA+菌株的分离表征与酶促机理上取得一定研究进展，但关于其作用水解酶，尤其是MlrA 的认识尚不充分，仍有许多问题有待探究。

（1）MlrA的底物识别与作用方式尚不明确

MCs 的分子特性赋予其丰富的结构灵活性，已从自然环境中检测到至少246 种MCs 的变体同源物[59]。然而，目前降解研究主要集中在MC-LR、MC-RR 及MC-YR 三种毒素上，对不同底物催化作用认识的局限性导致MlrA 的底物选择机制及作用肽键尚存争议。Valeria 等[60]从阿根廷San Roque 水库分离出一株与MC-LR 降解菌株同源的鞘氨醇单胞菌Sphingomonas sp. CBA4，该菌在36 h 内可降解初始浓度为0.2 mg·L-1的MC-RR。但在分析该菌的降解途径时，未检测到任何与MC-LR相似的已知中间产物，CBA4 通过去甲基化作用分解MC-RR。Wang 等[61]发现Sphingopyxis sp. USTB-05 降解MCRR 的酶促途径与MC-LR 相似，首先通过MlrA 断裂Adda-Arg 肽键使MC-RR 开环，但MlrA 在作用时还经过了两个额外脱水缩合步骤，最终生成含有两个小肽环的线性产物。这些发现在丰富MCs 微生物降解机制的同时也为认识MlrA 的催化特性带来一定困难，使MlrA 的催化特性无法拓展至不同种类的MCs。王 俊 峰[62]提 出MlrA 首 先 攻 击MC-RR 中Adda-Arg 之间的肽键是由于该肽键键能较小，容易断裂。该假说可能为理解MlrA 的作用特性提供建设性意见。

尽管学者普遍认为在MCs 降解过程中存在不同的酶促途径，但由于检测方法受限始终无法完全检测其中的中间产物，因此对MlrA 的作用方式认识不清[63]。Hashimoto 等[64]采用高级Marfey 法检测出B-9 菌降解MC-LR 的完整过程涉及多种中间产物，虽未明确MlrA 在其中发挥哪些作用，但该发现可为阐明MlrA的识别机制提供支持。

（2）MlrA的分子结构尚未解析

在MlrA 的氨基酸序列中，存在长段未注释功能区，如图5 所示。基于Sphingopyxis sp.ACM-3962 基因文库筛选，Bourne 等[14]发现克隆缺失任何片段的mlrA基因将导致MlrA 在异源宿主中失活，这表明在MlrA 的结构中可能存在尚未发现的功能区域。目前还未有研究报道通过X-Ray 或NMR 技术测定MlrA 的分子结构。以低同源性蛋白晶体为模板对MIrA 进行分子模拟可以为理解MlrA 的水解机制提供一定认识，但无法精确洞察其发挥功能的活性中心，确定与底物的结合方式。MlrA 三维结构的测定显得尤为重要。

图5 MlrA的结构域组成Fig.5 Domain organisation of MlrA

蛋白质结构生物学的首要难点在于目的蛋白的纯化结晶。关于MlrA 的纯化研究鲜有报道。回顾前文，MlrA 纯化的主要困难可能是具有膜相关性。根据Dziga 等[28]研究报道，在天然或变性条件下重组MlrA 不与树脂结合，且洗涤剂（1% Triton X-100）回收效率极低，因此无法使用亲和层析进行纯化。纯化无效可能是洗涤剂作用。Triton X-100能溶解细胞膜脂质，但MlrA 具有强疏水性，在洗脱时可能会破坏蛋白结构使酶失活。Manya 等[65]在纯化酵母膜蛋白POMT 时发现，离子洗涤剂或两性洗涤剂较Triton X-100 相比可有效纯化POMT，使酶活保持稳定。该发现可能为MlrA 的纯化提供思路。

总之，MlrA 的结构研究仍处于起步阶段，对MlrA 的晶体研究有助于更深层次地理解其生物学功能和分子进化关系，为分子设计与改造提供研究基础。

6 展 望

蓝藻水华已蔓延至全球108 个国家，其中超过70%的地区有MCs 检出记录[66]。作为自然环境下MCs 的主要衰减机制，研究微生物降解作用的重要性不言而喻。截至目前，MlrA 的异源表达已取得较大进展，但如何通过蛋白质工程或酶工程将重组酶在自然水体中高效、稳定且规模化应用仍有待探索。未来研究工作需首要明确MlrA 的结构功能关系，联合蛋白质组学与基因组学的新兴技术，着重考虑酶制剂或微生物制剂的工业生产与运作管理，进一步扩大MlrA 的适用范围和应用潜力。具体研究可从如下几个方面展开。

(1) MlrA 在实验条件下可能以二聚体形式存在[28]，通过远程配体结合仍有机会形成金属依赖性催化中心[41]。因此，积极开展MlrA 的晶体学研究，通过试验精确解析其分子结构，可进一步完善MlrA的水解机制。

(2) 以MlrA 的酶结构与功能关系为基础，通过基因工程或化学修饰技术进行分子改造[67]，使其在异源宿主中能够长期保持高密度、高稳定的正确表达，以达到工业生产要求。

(3)游离酶通常在极端环境（如高温、高离子浓度、强酸、强碱等）下容易失活[68]。通过研究酶与带电表面间的相互作用，使用物理化学法将MlrA 固定至酶载体，可增强其环境耐受性，提高催化效率。