邹坤 路丽丽 Collins Asiamah Amponsah 薛缘 张少伟 苏瑛 赵志辉

（广东海洋大学农学院，湛江 524088）

卵泡闭锁是一种多因素调控的选择性的细胞凋亡的生理现象。自从1976 年Gilbert［1］第一次用机械分离法将鸡卵泡颗粒细胞和膜细胞分离培养后，研究者开始在其基础上对卵泡内细胞培养体系进行改良和优化，为卵泡发育和闭锁的研究奠定了基础。目前，大量研究表明卵泡闭锁的根本原因是由颗粒细胞的凋亡引起的［2-4］。然而，在哺乳动物的研究中发现卵泡闭锁不仅是颗粒细胞的凋亡，而且是颗粒细胞自噬到凋亡的一个过程，自噬的发生先于凋亡，二者存在动态平衡的关系，并证明了颗粒细胞的自噬和凋亡呈促性腺激素依赖性［5-6］。由此可见，针对卵泡闭锁的机制仍有待进一步探讨，尤其在家禽方面，将对挖掘家禽的产蛋性能有重大意义。因此，本文对近几年关于卵泡内细胞自噬和凋亡引起卵泡闭锁的研究进行综述，旨为家禽卵泡闭锁机制的研究提供理论依据。

1 闭锁卵泡内细胞形态学变化

家禽卵泡闭锁在卵泡发育的各个时期都有发生，具有明显的形态学特征变化。当闭锁发生时，卵泡由圆润饱满开始皱缩变形，颜色由光亮变灰暗并有明显出血点［3］。一般卵泡闭锁分为两种形式：一种是始于卵母细胞，即在卵泡发育前卵母细胞直接发生凋亡引起卵泡闭锁；一种是始于颗粒细胞，即在发育过程中由于颗粒细胞凋亡而引起卵泡闭锁［7-8］。根据结构的变化，颗粒细胞凋亡形式分为两种，第一种是正常颗粒细胞之间在原位发生凋亡；第二种是颗粒细胞脱落到卵泡腔内形成凋亡小体发生凋亡［9］。Lin 等［10］对哺乳动物卵泡颗粒细胞研究发现，闭锁卵泡中的颗粒细胞层和膜细胞层明显变的松散、破裂、凹陷、甚至脱落。黄正洋等［9］在鹅的闭锁卵泡发现与Lin［10］在哺乳动物闭锁卵泡的发现基本一致，并通过透视电镜发现正常卵泡有明显边界，而闭锁卵泡边界不清晰，且还发现闭锁卵泡颗粒细胞层与膜层边界不明显。这种现象可能是由于发生卵泡闭锁后，细胞内的细胞器以及各种内容物被分解附着在卵泡边界所致。以上结果表明，哺乳动物与家禽的卵泡闭锁的形态学变化基本一致，先是颗粒细胞线粒体、内质网等生物学活性减弱，通过分泌细胞信号因子抑制膜细胞与外界的物质交换，同时抑制卵母细胞的活动，在颗粒细胞的主导下三者共同作用调控引起卵泡发生闭锁［11-13］。据报道，Choi 等［14］在体外利用细胞饥饿法诱导颗粒细胞凋亡，用荧光免疫染色法对颗粒细胞染色观察，发现颗粒细胞出现正常的核皱缩、破裂等凋亡现象。在透视电镜下还发现大量颗粒细胞出现细胞质累积，双膜结合的空泡，细胞器发生变化，大量自噬体累积等现象。郭燕君等［15］通过对小鼠微管相关蛋白1轻 链3（Microtubule-associated proteins light chain 3，LC3）的定位也发现颗粒细胞凋亡过程中伴随着大量自噬体的产生。以上研究结果表明，颗粒细胞自噬可能也是卵泡闭锁的一种调节方式。

2 卵泡内细胞调控

家禽卵泡闭锁的发生与颗粒细胞、膜细胞、卵母细胞或次级卵母细胞之间的调控密切相关。它们之间通过信号传导、物质交换及转化等方式共同维持卵泡内环境的稳定，防止卵泡闭锁的发生。综述下文文献报道，其简化调控模式图见图1。

2.1 卵母细胞调控机制

图1 卵母细胞、颗粒细胞、膜细胞之间相互调控关系

家禽卵母细胞是卵泡内最大的细胞，被颗粒细胞和膜细胞包裹，它调控卵泡闭锁的机制主要与原始卵泡的启动有关。据报道，原始卵泡的生长发育启动是由颗粒细胞分泌的干细胞因子（Stem cell growth factors，SCF）结合卵母细胞上的c-kit 受体共同完成，此过程并不依赖激素调节［16］。若原始卵泡未接收到启动信号，卵母细胞则一直处于“休眠状态”，最终在颗粒细胞分泌的白细胞介素1β（Interleukin- 1β，IL1-β）和肿瘤坏死因子α（Tumor necrosis factor，TNF-α）的作用下原始卵泡开始皱缩、裂解，最终发生闭锁，在3 日龄之前鸡会有90%的原始卵泡发生闭锁［7，17-18］。当卵母细胞接收到启动信号后，在SCF 的作用下卵母细胞分泌生长分化因子（Growth differentiation factor 9，GDF9）作用颗粒细胞，促进颗粒细胞上促卵泡素受体（Folliclestimulating hormone receptor，FSHR）的率先表达，FSHR 在FSH 的作用下正反馈调节卵母细胞，增强GDF9 信号作用，同时GDF9 作用膜细胞促进膜细胞上类固醇合成急性调节蛋白（Steroidogenic acute regulatory protein，StAR）与细胞色素P450 家族 的17A1/19A1（CytochromeP450，Family 17 /19，Subfamily A，Polypeptide1，CYP17/19A1）的表达和细胞膜上内质网的活性［19］。颗粒细胞上的FSHR 的表达也标志着卵泡发育的启动［3］。Yongje［20］通过下调GDF9 的表达发现颗粒细胞的增殖分化受到抑制，因此GDF9 可能是颗粒细胞增殖的必须因子，但也有研究发现卵母细胞的启动信号受抗缪勒氏激素（Anti-mullerian hormone，AMH）的调 控［17-18］，其具体机制仍有待进一步研究。通过抑制或敲除鸡FSHR 在颗粒细胞的表达，则会导致孕酮、雌激素、LH、TGFβ 等迅速下调甚至不表达，卵母细胞快速进入凋亡期，导致卵泡发生闭锁［21-23］。因此，GDF9 和FSHR 的下调可能是引起卵母细胞凋亡，进而调控卵泡闭锁的重要原因。

2.2 颗粒细胞调控机制

家禽卵泡颗粒细胞是卵泡内数量、比重以及功能最多的细胞，它的增殖分化和凋亡主导卵泡的发育，决定卵泡的闭锁。在家禽正常发育阶段，家禽卵泡闭锁主要与其严格的选择机制有关。只有被选择的卵泡的颗粒细胞才具有较强的分化能力，在FSH 的作用下颗粒细胞迅速增殖分化进入优势卵泡阶段［22，24-25］。未被选择的卵泡颗粒细胞FSHR 表达量下调甚至不表达，FSH 与FSHR 结合的活性减弱，抑制颗粒细胞膜环磷酸腺苷（Cyclic adenosine monophosphate，cAMP），通过下调cAMP的浓度抑制cAMP-PKA 信号通路。颗粒细胞的转录活性下降，CYP11A1、CYP17A1、StAR 等重要固醇转运蛋白下调，同时下调颗粒细胞上雌激素受体（Estrogen receptor，ESR）、胰岛素样生长因子受体（Insulin like growth factor receptor，IGFR）、黄体素受体（Luteinizing hormone receptor，LHR）等受体的表达［11，26-28］。随着FSH 的作用减弱，与其级联反应的cAMP 依赖蛋白激酶A（Protein kinase A，PKA），P13K/Akt 信号均被抑制［29］。此外，FSH 的作用减弱导致颗粒细胞膜上Ca2+的浓度下调上游蛋白Ras，Ras 下调丝裂原活化蛋白激酶（Mitogen-activated protein kinase，MAPK）家族信号通路，ERK1/2 的作用被减弱，颗粒细胞周期蛋白cyclinD2 的合成停止。同时，ERK5 信号通路增强，激活Caspase 信号通路，促进颗粒细胞凋亡［30-31］。随着颗粒细胞上ESR、FSHR 等G 蛋白偶联受体的表达量下调，它们可与IGF、转化生长因子（Transforming growth factor，TGF）等家族的受体构成的复合受体在溶酶体的作用下裂解，颗粒细胞的一系列生理活动逐渐停止，凋亡信号增强［32-34］。Wang 等［35］利用转录组富集信号通路发现，在鸡等级卵泡选择过程中，被选择优势卵泡过程中还存在较强Wnt4 信号的调控，而闭锁卵泡中Wnt4 的信号富集显著弱于优势卵泡，说明Wnt4 信号的减弱可能也会引起卵泡闭锁。在凋亡因子的作用下，卵泡内颗粒细胞由整齐紧凑逐渐变得疏松凌乱，最终卵泡发生闭锁。

颗粒细胞的凋亡是引起卵泡闭锁的根本原因，而颗粒细胞的凋亡主要受细胞凋亡因子的调控。卵泡闭锁早期，卵泡内固醇的合成以及生长因子无显著差异变化，而是颗粒细胞上的FSHR、ESR、LHR等受体的数量减少，一系列蛋白合成以及酶的活性降低，线粒体活动减弱［21］。随即颗粒细胞凋亡诱导因子（Apoptosis inducing factor，AIF）的表达量升高，细胞膜上的FAS 和FASL 信号作用增强，Akt信号通路作用B 淋巴细胞瘤2（B-cell lymphoma-2，Bcl2），Bcl2 的磷酸化和氧化作用增强，释放Bax、Bak，与其联级的Caspase3 信号作用也增强，并通过Caspase8 切割Bcl2 正反馈调控凋亡信号，在TNF-α 和IL-β 的作用下进入凋亡程序。在颗粒细胞凋亡信号的作用下，膜细胞随着颗粒细胞的凋亡而凋亡，最终卵母细胞也随之凋亡。当颗粒细胞的凋亡率达到10%时，标志着卵泡进入闭锁状态［36］。卵泡在发育过程中受到多种信号通路的调控，但其信号通路的作用强度依赖颗粒细胞内的激素及受体作用。

2.3 膜细胞调控机制

家禽卵泡膜细胞位于卵泡膜内侧，颗粒细胞层外侧，是连接卵泡内和卵泡外物质和信号交流的重要通道，也是卵泡内固醇合成加工的重要场所。卵泡膜细胞层主要由膜细胞、毛细血管和基底膜构成，在膜细胞的表面含有大量的滑面内质网以及脂类物质构成的小泡状结构。Gan 等［37］发现CYP17A1 和CYP19A1 主要表达在膜细胞，它们的密度、生存能力和它们合成固醇类物质的能力趋势是一致的。当卵泡发生闭锁时，凋亡信号增强，负反馈作用颗粒细胞和卵母细胞GDF9 的分泌，抑制膜细胞的增殖分化。膜细胞在凋亡因子的作用下，CYP17A1、CYP19A1 和StAR 被抑制甚至失活，而CYP17A1、CYP19A1 和StAR作为cAMP的依赖基因，因此cAMP-FSHR 信号的传导也被抑制［24，38］。此外，家禽卵泡排卵时，会形成临时分泌器官黄体，而膜细胞是通过丰富的毛细血管为颗粒细胞和黄体提供连接桥梁。由膜细胞分泌的BMP 减少，卵泡膜上毛细血管系统的发育受到阻滞，通过毛细血管连接以及膜连接与卵泡外进行营养物质的交换、信息交流以及生长因子的转化能力减弱；另一方面通过间隙连接颗粒细胞为颗粒细胞和卵母细胞的发育提供营养物质和信息交流逐渐停止，加速卵泡闭锁过程［24，39］。更为重要的是，膜细胞是雌激素、雄激素和孕酮等固醇合成和转运的主要场所［40］。膜细胞在LH 的作用下促进CYP17A1 和CYP19A1 的大量表达，同时活化膜上的芳香化酶，膜细胞通过将卵泡外的固醇类物质合成雄激素，维持卵泡内必须的雄激素含量外，在芳香化酶的作用下可将自身合成的雄激素以及颗粒细胞分泌的雄激素转化为雌激素，刺激颗粒细胞的发育［41］。当膜细胞分泌大量雌激素时，雌二醇会负反馈作用LH 信号，维持卵泡内雄激素和雌激素动态平衡［36，42］。因此，CYP17A1 和CYP19A1 的失活可能打破卵泡内激素动态平衡，是引起卵泡闭锁的一个重要因素。此外，Hattori 等［43］通过将膜细胞和颗粒细胞共培养发现，膜细胞LH轴可以通过旁分泌上调雄激素或雌激素的合成激活IGF 信号抑制颗粒细胞凋亡和卵泡闭锁。综上所述，膜细胞参与卵泡闭锁可能与细胞间信息交换和卵泡内激素平衡有关。

3 颗粒细胞自噬

卵泡内细胞自噬主要是卵泡在其发育过程中净化自身参与或者受损细胞器的作用机制，机体借此维持蛋白代谢的平衡。目前，关于自噬调控家禽卵泡闭锁的研究主要在颗粒细胞自噬，其调控机制主要包括两个方面：（1）负调控因子m-tor 信号通路。（2）正调控因子JNK 信号通路。在鸡颗粒细胞自噬的过程激活凋亡信号，二者共同调控卵泡闭锁［44］。

颗粒细胞自噬主要发生在等级卵泡发育阶段，尤其在优势卵泡选择之后，卵泡发育中颗粒细胞自噬对促性腺激素（Gonadotropic hormone，GnH）呈线性负相关［5，9］。哺乳动物颗粒细胞在GnH的作用下，FSH 通过上调P13K/AKT 信号，增加AKT 和S6K 的磷酸化，活化m-tor 信号，m-tor 通过m-torc1 的作用增强细胞内的活性蛋白合成，提高细胞活性并抑制LC3-II 和Caspase3 的表达，抑制细胞自噬和凋亡［45］。也有研究表明，FSH 也可以直接通过m-tor 活化因子MHY1485 的作用激活m-tor 显著抑制自噬信号，但通过FSH 处理颗粒细胞发现，FSH 可显著上调低氧诱导因子1（Hypoxia inducible factor1α，HIF1α）的表达，并通过HIF1α 的作用诱导自噬信号的传导引起卵泡闭锁［46］。m-tor 作为m-tor/HIF1α 轴的上游主要信号因子，FSH 通过活化HIF1α 的作用可能远远弱于m-tor 的信号作用［47-48］。因此，m-tor 信号通路在颗粒细胞自噬调节具有重要作用，但在家禽卵泡闭锁过程中的机制仍有待进一步研究。此外，FSH也可参与颗粒细胞自噬正向因子JNK 信号通路。Gao 等［49］发现FSH 通过抑制核转录因子（Nuclear factor-kappa B，NF-κB）的水平，促进p65 在颗粒细胞细胞质的表达，在p65 的作用下增强JNK 信号，JNK 通过对Bcl2 的磷酸化抑制Bcl2 的作用，并降低“自噬调节器”Beclin1 和Bcl2 的结合能力或者使Beclin1-Bcl2 复合体分离，使Beclin1 的作用机制增强，诱导细胞自噬引起卵泡闭锁发生［50-51］。据报道，Beclin1 主要表达于鸡膜细胞，通过与 LC3β-II 相结合，下调p62 和上调Beclin1 的作用，显著增加膜细胞层的自噬活性，并且Beclin1 诱导Caspase3的表达促进颗粒细胞凋亡［44］。该结果表明，Beclin1的表达可能与膜细胞存在密切的关系，并可推测颗粒细胞的自噬可能取决于膜细胞的调控。综上所述，在细胞自噬信号的传导过程中伴随着Bcl2 和Caspase3 等凋亡信号的产生，因此颗粒细胞凋亡和自噬可能共同调控卵泡闭锁。

另一方面，颗粒细胞自噬还受其它多种因素调控。Yu 等［52］发现鹅卵泡内环境的不均衡会引起自噬正调控因子miR-7，miR-29，miR-100，miR-181，PRLR，LC3，p53，Beclin1，Atg9 和Atg12的表 达上调，负调节因子miR-34b 和miR-34c 的下调导致颗粒细胞自噬。Lou 等［53］发现颗粒细胞的氧化损伤通过抑制m-tor 和促进p53 信号通路调节颗粒细胞自噬，但褪黑素可以通过GFP-MAP1LC3B 和SQSTM1降解Beclin1 靶向抑制JNK/Bcl2/Beclin1 信号传导，也可以通过介导FOXO1 脱乙酰化及其与ATG 蛋白的相互作用以及抑制氧化应激的颗粒细胞中自噬需要SIRT1 信号传导的激活，抑制颗粒细胞因氧化损伤发生自噬［54-55］。Kang 等［56］通过3-硝基丙酸（3-nitropropionic acid，3-NPA）刺激鹅颗粒细胞氧化应激反应发现，抑制Bcl2 促进Caspase3 的表达，引起颗粒细胞自噬和凋亡。引起卵泡颗粒细胞发生自噬的因素众多，但自噬的发生最终途径都涉及到m-tor 信号或JNK 信号的调控，并且伴随着凋亡的发生。因此，通过应用m-tor 激动剂或者JNK 信号抑制剂可能对家禽因自噬导致卵泡闭锁具有较好疗效。

4 展望

家禽卵泡闭锁受凋亡和自噬共同调控，影响家禽的产蛋性状，但适量的卵泡闭锁会加速优势卵泡的发育和排卵，并有研究发现颗粒细胞自噬和凋亡过程中产生的TNFα 可以通过减少卵母细胞释放数量和诱导未破裂卵泡的颗粒细胞死亡重塑卵巢组织［57］。因此，家禽繁殖性能与卵泡闭锁数量相关，如何建立一个闭锁标准，充分挖掘家禽的产蛋性状是一个值得探究的问题。此外，在哺乳动物中被认为颗粒细胞凋亡开关的Dicer 酶可通过抑制黄体的形成引起卵泡闭锁［58］，而家禽不同于哺乳动物存在明显的黄体，仅在家禽排卵时作为临时分泌器官出现，是否该酶在家禽卵泡闭锁的调控机制与哺乳动物相同，Dicer 酶也是合成microRNA 和siRNA 的必须酶，microRNA 和siRNA 在颗粒细胞、膜细胞和卵母细胞之间可能有着重要的传递信息的功能，在分子辅助生殖技术中，将microRNA 在各细胞中的丰度作为评价卵泡成熟和重量的一个重要指标［59-60］。随着第三代测序技术的发展，对microRNA、siRNA以及circRNA 等小片段RNA 的挖掘更全面，笔者认为，在未来进一步完善小片段RNA 在颗粒细胞的凋亡和自噬的调控网络对家禽繁殖性状具有重要意义。