刘鹏 岑妍慧 林江 梁忠秀 兰太进 韩丝银 陈振兴

（广西中医药大学基础医学院 医学创新综合实验室，南宁 530200）

创伤弧菌（Vibrio vulnificus）主要分布在热带及亚热带近海岸地区，为嗜温、嗜盐、嗜碱型革兰氏阴性细菌，是一种重要的人-鱼共患致病菌［1］。2006 年8 月，Emerging infectious diseases杂志将创伤弧菌列入最危险的细菌行列。该菌通过污染的海产品（尤其是生蚝、海洋贝类产品）或伤口接触感染人类，严重危及人类生命［2-3］。创伤弧菌可导致皮肤起泡溃烂、坏死性筋膜炎、败血症、急性肠胃炎和感染性休克，55%以上的败血症患者在发病48 h内因多器官功能衰竭而死亡；免疫功能低下的患者属于易感人群，尤其是有基础性疾病的患者，如慢性肝炎、肝硬化、酗酒和遗传性血色沉着病，以及有慢性疾病如糖尿病、风湿性关节炎、慢性肾衰和淋巴瘤患者，严重感染该病原体的风险较高［4］。另男性相比女性更易发生感染，占比86%，是女性的6 倍。且在男性群体中，创伤弧菌倾向于感染年长男性（＞40 岁）［5］。且值得注意的是，最近有越来越多的报道显示健康宿主通过伤口感染创伤弧菌。

对于感染创伤弧菌患者，在大部分情况下，必须通过外科手术来清理创口，避免创伤弧菌快速增殖［6］。目前对创伤弧菌的致病机理并不明了，但可以肯定的是，其原因是多方面的。如创伤弧菌具有多种公认的毒力因子，如溶血素、弹性蛋白酶、荚膜多糖、脂多糖和胶原酶等［7］。此外，毒素多功能自动重复序列（Multifunctional-autoprocessing repeatsin-toxin，MARTX）毒素亦存在于创伤弧菌中，在其致病性中承担重要角色，创伤弧菌可利用MARTX毒素蛋白抵抗宿主免疫防御，使细菌在宿主体内增殖扩散［8］。

上述毒力因子大部分都是蛋白质，可见蛋白质的翻译质量对于细菌的生存、毒力等方面发挥重要作用。而几乎所有的原核微生物中，均有一套由转移信使RNA（Transfer-messenger RNA，tmRNA）和小蛋白B（Small molecular protein B，SmpB）介导的反式翻译系统。细菌主要通过该系统确保蛋白质翻译质量，对致病菌的毒力因子的表达、维持细菌内稳态和在逆境下的生存能力等方面发挥着非常重要作用［9］。因此本研究以海洋致病菌创伤弧菌为研究对象，对其反式翻译系统核心蛋白SmpB 进行基因克隆及原核表达，旨为后续进一步研究SmpB 蛋白与创伤弧菌致病性之间的关系奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株与试剂 创伤弧菌（Vibrio vulnificus）标准菌株ATCC27526，购自上海士锋生物科技有限公司；E. coliDH5αD、E. coliBL21 菌株以及含pET-28a载体的大肠杆菌，均为实验室保存菌株；卡那霉素、异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside；IPTG）购自碧云天生物技术研究所；Pfu mix DNA 聚合酶、高纯度质粒小量提取试剂盒购自广州东盛生物科技有限公司；PCR 产物回收试剂盒购自江苏溥博生物科技有限公司；限制性内切酶EcoR I-HF、XhoI、T4 DNA 连接酶购自NEB公司；引物及测序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

1.1.2 主要仪器与设备 NanoDropTMOne/Onec微量紫外可见光分光光度计，美国Thermo Scientific 公司；THZ-300C 型恒温摇床（可制冷）、上海一恒科学仪器有限公司；XY-SH-150- ⅢY-SH-150-XY-JH-11C型个人型单面超净台，上海昕仪仪器仪表有限公司；T100 型梯度PCR 仪、GelDoc XR+型全自动凝胶成像系统、PowerPac Universal 型通用电泳仪、1658001小型垂直电泳槽，美国Bio-Rad 公司；HE-120 多功能水平电泳槽，南京普阳科学仪器研究所；YXQLS-100A 型内循环立式压力蒸汽灭菌器，上海博迅医疗生物仪器股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 创伤弧菌基因组DNA 的提取 创伤弧菌富含荚膜多糖，使用常规DNA 提取方法无法有效获取基因组DNA。因此，参照侯卫国等［10］的文献，采用LiCl 沉淀法提取创伤弧菌基因组DNA。提取后进行琼脂糖凝胶电泳检测，以及使用NanoDropTMOne/Onec微量紫外可见光分光光度计（美国Thermo Scientific 公司）测定基因组DNA 浓度及纯度，-20℃保存备用。

1.2.2 引物设计 根据GenBank 数据库公布的V.vulnificusCECT 4999菌株smpB基因序列（NZCP014636），使用Oligo6软件设计一对引物：F：5'-CGGAATTCATGGCAAAGAAAAATTCAAAAC-3'和R：5'-CCGCTCGAGACGCAGCGAGCTCTTCATC-3'，在引物5'端分别添加原核表达质粒pET-28a 多克隆位点中所包含的EcoRI和XhoI酶切位点及对应的保护碱基，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2.3smpB基因的扩增 以创伤弧菌基因组DNA为模板，利用Pfu DNA 聚合酶PCR 扩增smpB基因，其片段大小为486 bp。PCR 反应体系为：2×Pfu mix 25 μL，SmpB-F（10 μmol/L）1 μL，SmpB-R（10 μmol/L）1 μL，创伤弧菌基因组DNA1μL，ddH2O 22 μL，反应总体积为50 μL。瞬间离心混匀，进行PCR 扩增，扩增反应条件为：94℃预变性3 min，94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，共30 个循环，72℃后延伸5 min。PCR 扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，并使用PCR 产物回收试剂盒纯化回收。

1.2.4 重组原核表达质粒的构建 将纯化回收的PCR 产物和原核表达载体pET-28a 分别经EcoRI和XhoI双酶切，再使用PCR 产物回收试剂盒纯化回收酶切片段，酶切载体片段与酶切目的片段按1∶3的比例，进行T4 DNA 连接酶4℃过夜酶连，连接产物经热激法转入E. coliDH5αDH5αli 产物经热激法转入，酶切载50 μg/mL 卡那霉素的LB 固体平板上，挑取单菌落，转接到新的含卡那霉素的LB 平板上，进行菌落PCR 验证，扩增产物使用1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。挑取阳性克隆子，接种到5 mL 含卡那霉素的LB液体培养基中，37℃ 150 r/min振荡培养过夜，高纯度质粒小量提取试剂盒提取重组质粒，送往生工生物工程（上海）股份有限公司测序。

1.2.5 生物信息学分析 对测序获得的smpB基因序列，使用DNAMAN 9.0 软件进行翻译，获得其氨基酸序列；使用ExPASy ProtParam 在线工具（https：//web.expasy.org/protparam/）分析SmpB 蛋白的理化性质，TMHMM 2.0 在线工具（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）分析跨膜区域；使用SignalP 3.0 在线信号肽预测工具（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-3.0/）进行信号肽预测；使用NetPhos 3.1（http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）进行磷酸位点分析；使用JPred 4.0（http：//www.compbio.dundee.ac.uk/jpred/）预测二级结构，Swiss-Model 对其高级结构进行预测；最后通过String 蛋白质相互作用预测网站（https：//string-db.org/），预测创伤弧菌SmpB 蛋白的互作网络。

1.2.6 SmpB 蛋白的诱导表达 将测序正确的重组原核表达质粒热激法转入大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞中，复苏涂布到含50 μg/mL 卡那霉素的LB固体平板上，挑取阳性克隆子，转接到5 mL 含50 μg/mL 的LB 液体培养中，37℃振荡培养过夜，按1%的比例转接到200 mL 含卡那霉素的LB 液体培养基中，37℃振荡培养3-4 h，待OD600达到0.4-0.6 时，加入IPTG 至终浓度为100 μmol/L，25℃振荡诱导表达5 h，同时设置不加IPTG 诱导剂组，最后均4℃4000 r/min 离心10 min，收集菌体，加入适量预冷PBS 悬浮，在冰水条件下进行超声破碎，破碎功率为300 W，工作时间5 s，间歇时间6s，全程时间45 min。4℃ 12 000 r/min 离心10 min，收集上清及沉淀，进行12% SDS-PAGE 凝胶电泳分析。

2 结果

2.1 创伤弧菌基因组DNA提取

按照侯卫国等［10］的文献报道提取海洋创伤弧菌基因组DNA，进行琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统拍照，结果如图1，条带清晰无杂质，使用NanoDropTM One/Onec 微量紫外可见光分光光度计检测基因组DNA 的OD260/OD280和OD260/OD230分别为1.83 和2.22，表明其纯度较好，浓度为 28.4 ng/μL，可用于后续实验。

2.2 创伤弧菌smpB基因扩增

图1 创伤弧菌基因组DNA 电泳图

创伤弧菌smpB基因的PCR 扩增产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，可见约486 bp 的特异条带，大小与预期一致，如图2。使用PCR 产物回收试剂盒纯化回收PCR 扩增产物，经NanoDropTM One/Onec微量紫外可见光分光光度计检测，其质量浓度为101.5 ng/μL，OD260/OD280和OD260/OD230值各 为1.83和2.35，满足后续实验要求。

图2 创伤弧菌smpB 基因PCR 扩增产物电泳图

2.3 重组原核表达质粒的构建

将创伤弧菌smpB基因PCR 产物双酶切片段和pET-28a 双酶切片段进行T4 DNA 连接酶酶连后，热激法转入大肠杆菌DH5α 后，复苏后涂布到50 μg/mL 卡那霉素的LB 固体平板上培养，对长出来的单菌落使用通用载体引物进行菌落PCR 验证，结果如图3，1-3 号，5-8 号可见约800 bp 的特异条带，包含目的基因及载体部分片段，其大小与预期一致，为目的阳性克隆子。挑取阳性克隆子，接种到含卡那霉素的LB 培养液中，振荡培养过夜，提取质粒测序，测序结果表明，克隆的smpB基因序列与GenBank 报道的序列一致，表明成功构建好原核重组表达质粒pET-28a-SmpB。

图3 阳性克隆子菌落PCR 鉴定电泳图

2.4 生物信息学分析

DNAMAN 9.0 软件翻译测序获得的smpB基因序列，获得其氨基酸序列如图4，共161 个氨基酸。与GenBank 报道的创伤弧菌smpB基因序列一致。

ExPASy ProtParam 在线分析软件分析SmpB 蛋白的分子式为C808H1331N247O230S7，预测蛋白质分子量约为18.41 kD，理论等电点为10.28。SmpB 蛋白含18 个带负电荷的氨基酸残基（天冬氨酸和谷氨酸）及33 个带正电荷的氨基酸残基（精氨酸和赖氨酸）。其蛋白不稳定系数为35.02＜40，为稳定蛋白，总平均亲水性（GRAVY）为-0.635＜0，表明该蛋白为亲水蛋白。TMHMM 结果显示SmpB 蛋白并不形成跨膜结构，主要定位于胞质溶胶中。NetPhos 3.1 结果表明SmpB 蛋白可能含有11 个磷酸化位点，其中丝氨酸7 个、苏氨酸3 个、酪氨酸1 个。我们使用Jpred4预测了创伤弧菌SmpB 蛋白二级结构，结果显示主要由7 个β 折叠、3 个α 螺旋组成，如图5-A。同时，以耻垢分枝杆菌Mycobacterium smegmatis SmpB 电子显微镜结构为模板（PDB ID：5zeyC），Swiss-Model预测的SmpB 高级结构如图5-B，其中核心结构为5个β 折叠组成，C 端30 个氨基酸形成α 螺旋。

String 方法对创伤弧菌SmpB 蛋白进行互作预测结果显示，SmpB 蛋白与10 种蛋白质存在相互作用，其中50S 核糖体蛋白L19（50Sribosomal protein L19，RplS）、苯丙氨酸tRNA 合成酶A 氨酸iphenylalanyl-tRNA synthetase subunit alpha，PheS）、核糖核酸酶R（Ribonuclease R，RNase R）与SmpB蛋白互作比较显著（图6）。

图4 创伤弧菌smpB 核苷酸序列及推测的氨基酸序列

图5 创伤弧菌SmpB 二级结构和三级结构预测

2.5 重组大肠杆菌的诱导表达

SDS-PAGE 凝胶电泳结果显示，可见pET-28a-SmpB 的诱导表达产物在25 kD 附件有一条特异蛋白条带（图7），虽然表观分子量要大于理论分子量，分析可能是融合了6 个组氨酸标签，组氨酸是碱性氨基酸，具有强正电荷，会改变SmpB 蛋白在SDSPAGE 凝胶中的泳动，降低其泳动速率，导致出现滞后现象，表观分子量在一定范围内变大［11］。

图6 创伤弧菌SmpB 相互作用蛋白预测

图7 创伤弧菌SmpB 表达产物SDS-PAGE 凝胶电泳图

3 讨论

创伤弧菌是一种革兰氏阴性嗜盐细菌和机会性人类病原体，可引起原发性败血症和伤口感染［12］。由于其广泛存在于近海和海湾区域，一些生蚝、贝类等海洋产品可能受到创伤弧菌的污染，人们一旦生食，或者伤口接触到这样的海产品，均可能导致感染，对人们的健康带来巨大威胁［13］。目前创伤弧菌已成为全球最危险的海产食品病原体，其生物安全危害程度分级为3-4 级［14］。并且随着全球气温变暖，海洋温度上升，创伤弧菌感染发生率逐步上升［15］。因此深入研究创伤弧菌致病机制，寻找抗菌靶标，研发有效的疫苗具有重要意义。尤其是近年来越来越多研究报道，创伤弧菌对多种抗菌药物产生了不同程度的耐药性，开发新型抑菌靶标，研究新型抑菌药物变得更为迫切。

而几乎在所有的原核生物中，均存在一套由tmRNA-SmpB 介导的反式翻译系统，确保细菌蛋白翻译质量［16］。细菌在正常生长条件和逆境条件下，均有可能发生基因转录错误，mRNA 受损，翻译移码错误等问题。一旦出现mRNA 畸变，缺乏正常终止密码子，核糖体会卡在mRNA 链的3'端，无法释放下来，所产生的新生不完整肽链，会导致细菌中毒，同时占用了细菌中数量有限的核糖体，影响细菌的生长及毒力水平，而反式翻译系统就是纠正mRNA翻译畸变的一种主要的修复方式，通过其核心分子tmRNA 和SmpB 进行滞留核糖体的拯救，通过对新生的肽链加上一段10 个氨基酸长度的标签肽，被体内的管家蛋白酶识别水解掉，从而使滞留的核糖体释放下来，使核糖体、tRNA 等重新合成蛋白。此外除了翻译质量控制以外，反式翻译系统对细菌的耐压、基因调控表达、毒力水平以及生长水平等方面也起到重要作用［17］。

许多报道均表明反式翻译系统核心分子SmpB蛋白在细菌发病过程中起着重要作用。如Baumler等［18］报道鼠伤寒沙门氏菌SmpB 突变体在巨噬细胞内的生存能力出现降低，Okan 等［19］也报道假结核耶尔森菌SmpB 突变体，在巨噬细胞中的生存能力和增殖能力均下降，并且表现出对小鼠无毒现象，并发现SmpB 突变体在毒力效应蛋白的表达和分泌方面具有严重缺损。总之，SmpB 蛋白对于细菌毒力具有非常重要作用。而在创伤弧菌中，关于SmpB对于其毒力调控或致病机制方面的研究尚无相关报道，因此本研究通过克隆创伤弧菌smpB基因，构建其原核表达质粒，并成功可溶性表达，为后续重组蛋白SmpB 的纯化，以及深入研究SmpB 蛋白互作、SmpB 与创伤弧菌致病性之间的关系奠定基础，并为寻找抗创伤弧菌的新靶点提供一定的实验数据。

4 结论

成功克隆创伤弧菌反式翻译系统smpB基因，并成功构建pET-28a-SmpB 原核表达重组质粒，在E. coliBL21（DE3）中可以大量可溶性表达。