朱孟臻， 张 敏， 黄学芳

(1.陕西科技大学 化学与化工学院， 陕西 西安 710021； 2.陕西科技大学 环境科学与工程学院， 陕西 西安 710021)

0 引言

细菌感染问题一直制约着人们生活水平的提高，为了抑制细菌的产生和滋长，进而防止疾病的传播，使用具有抗菌性能的材料是最为简单有效的方法[1].近年来，新型的水凝胶抗菌材料[2]受到了研究者们的关注.水凝胶的三维网状结构以及丰富官能团[3]所表现出来的药物负载与可控释放的性能[4]使其成为了优异的抗菌材料的载体.除了壳聚糖及其衍生物水凝胶具有良好抗菌效果外[5]，大都采用水凝胶基材负载抗菌剂的方式达到抗菌的目的.常用的银系抗菌剂[6]、光触媒类抗菌剂[7]、纳米粒子抗菌剂[8]等抗菌能力已经得到验证，但仍有价格昂贵，不易回收，以及环境危害等问题亟待解决.

嗜酸乳杆菌作为益生菌，来源广泛且可再生，其在发酵过程中除产生乳酸、乙酸和双乙酰外，还能产生细菌素类抑菌物质[9]，所以嗜酸乳杆菌具有作为抗菌剂的潜力.它目前最广泛的应用是作为饲料添加剂来拮抗致病肠道菌，改善牲畜的肠道微环境以提高产量[10,11].

关于水凝胶负载菌种的研究，大部分是采用包埋的方式达到菌种固定和保存的目的[12]，张敏等[13]利用酵母菌发泡制备PVAL/CMC水凝胶以实现对染料的吸附与降解；张永栋等[14]采用PVA水凝胶包埋菌种，与植物联合除氮；另外壳聚糖，海藻酸钠水凝胶也常用于包埋酵母菌等菌种用于发酵工业[15,16].

本研究选取嗜酸乳杆菌作为抗菌剂，采用聚氨酯/聚乙烯醇水凝胶作为抗菌剂载体[17-20]，制备出了抗菌水凝胶RG-WPU/PVA.研究了载菌前后材料性能变化，材料配比对水凝胶载菌量的影响以及菌种释放行为.此外，还初步验证了负载嗜酸乳杆菌后的抗菌水凝胶的抗菌性.

1 实验部分

1.1 主要材料和仪器

1.1.1 主要原料及试剂

水性聚氨酯溶液WPU(MR-707 Tech)， 东莞米人占化工有限公司；聚乙烯醇PVA(1799H AR)， 国药集团化学试剂有限公司；嗜酸乳杆菌RG，西安德朗生物科技有限公司.

LB培养基：氯化钠NaCl 10 g(AR 天津市天力化学试剂)，酵母膏10 g，蛋白胨5 g，琼脂粉15 g(BR北京奥博星生物技术有限公司)，蒸馏水1 000 mL，pH调至7.0～7.2.

1.1.2 主要仪器

VECTOR-22型傅里叶变换红外光谱仪，德国Bruker公司；FEI Q45型扫描电子显微镜，美国FEI公司； Zetasizer Nano ZS型纳米粒度表面电位分析仪，Malvern公司；TGA-Q500型热重分析仪，美国TA仪器公司；D/Max-3c型 X-射线衍射仪，日本Rigalcu公司；UV-2600型紫外可见分光光度计，尤尼克(上海)仪器有限公司； ASAP2460型比表面积仪，美国麦克仪器公司；SW-CJ-1FD型超净工作台，苏州净化设备有限公司；SPX-250BS-II型生物培养箱，上海新苗医疗器械制造公司；LDZX-30FBS型高压灭菌锅，上海申安医疗器械厂；LGJ-10型冷冻干燥机，北京松源华兴科技发展有限公司.

1.2 WPU/PVA水凝胶的制备

称取絮状PVA 40 g，量取蒸馏水360 mL，浸泡12 h使其溶胀，然后在90 ℃下水浴加热溶解，搅拌速度100 r/min，溶解时间2 h，得澄清透明溶液，静置消泡过夜，使PVA分子链充分舒展，得到质量分数为10%的PVA水溶液；将WPU与PVA在60 ℃下共混，搅拌速度200 r/min，搅拌1.5 h，得到WPU/PVA混合溶液；将上述所得到的混合溶液倒入二十四孔板中，置于低温冰箱循环冷冻解冻3次，用去离子水洗净，得到WPU/PVA水凝胶.

因此，基于以上分析可以认为，在稳定增长的目标下，如果耐用品的寿命足够长，货币政策当局应选择耐用品部门通胀作为货币政策盯住目标，无论是基于缓和产出波动的角度，还是基于降低政策引致的社会福利损失的角度，均应如此。

1.3 RG-WPU/PVA水凝胶的制备

RG-WPU/PVA水凝胶：将RG菌从原料中筛选并纯化富集，并在其生长稳定期初始阶段将上述制备的湿态WPU/PVA水凝胶加入RG菌菌液中浸泡负载12 h，负载过程仍需震荡培养，防止形成菌膜影响后期负载量的计算.最终得到RG-WPU/PVA水凝胶.RG-WPU/PVA水凝胶的制备过程示意图如图1所示.

图1 RG菌负载水凝胶的制备过程示意图

2 结果与讨论

2.1 FT-IR分析

图2为PVA、WPU、RG菌、WPU/PVA水凝胶、RG-WPU/PVA水凝胶的FT-IR图.从图2可以看出，WPU/PVA的-OH吸收峰发生偏移， WPU在1 645 cm-1处的羧基吸收峰偏移至1 690 cm-1处，表明PVA与WPU之间发生了氢键交联；RG菌的3 600 cm-1处为菌种中游离-OH的吸收峰，RG-WPU/PVA的-OH吸收峰偏移到3 433 cm-1处，这是因为菌体与材料之间有了氢键所导致的峰位偏移，所以RG菌负载在水凝胶表面的过程中存有氢键的作用；2 945～2 870 cm-1为基材以及RG菌和其产物乳酸、胞外多糖[21]中的C-H的伸缩振动峰，1 645 cm-1处有菌体酰胺Ⅱ带面内变形振动，使峰形与峰位发生了变化[22].这一变化可能是由于菌体表面蛋白的氨基与基体中WPU的羧基发生相互作用.因为两个基团的电荷性质不同，所以菌体与材料之间可能还存有静电力的作用.

2.2 载菌水凝胶的负载机制

Zeta电位是带电颗粒表面剪切层的电位，可用于描述胶体颗粒之间的静电相互作用.将冷冻干燥后WPU/PVA水凝胶粉末、富集培养的RG菌菌粉、冷冻干燥RG-WPU/PVA水凝胶粉末等分散于不同pH的溶液中，测定Zeta电位，其结果如图3所示.由图3可知，WPU/PVA的零点电位小于1，RG菌株的零点电位为4，RG菌负载在WPU/PVA凝胶上后，其零点电位发生变化为2.70.由此可知，RG菌负载WPU/PVA水凝胶的过程中存有静电力的作用，这验证了章节2.1中的论断.

图3 RG菌、WPU/PVA水凝胶、RG-WPU/PVA水凝胶的Zeta电位图

2.3 SEM形貌观察

图4为WPU/PVA水凝胶和RG-WPU/PVA水凝胶冷冻干燥后的SEM照片.由图4可以看出，WPU/PVA的干燥凝胶属于大孔材料(孔径大于50 nm)，WPU/PVA体积比例不同，孔洞形态也有差异.其中，图4(b)、(c)所示三维结构呈现出较好的形态；图4(a)孔径大且不均匀；图4(d)、(e)显示随着PVA含量的增加，凝胶孔洞变小，结构发生了坍塌；将WPU/PVA比例为1∶2的凝胶浸泡载菌后，通过电镜观察可以看到，水凝胶孔壁周围有大量RG菌均匀附着其表面(图(f))，且水凝胶的孔洞结构仍然能够保持.

(a)WPU/PVA 1∶1 (b)WPU/PVA 1∶1.5

(c)WPU/PVA 1∶2 (d)WPU/PVA 1∶2.5

(e)WPU/PVA 1∶3 (f)载菌凝胶 图4 不同体积比例凝胶基体与载菌凝胶的电镜照片

2.4 BET测试

不同体积比例的WPU/PVA干燥水凝胶的比表面积的测试结果如图5所示.本研究所制得的水凝胶的比表面积整体偏小，小于0.5 m2/g，随着PVA含量的增加，比表面积先增大后减小.WPU/PVA体积比例为1∶2的干燥水凝胶比表面积最大，达到了0.421 2 m2/g；WPU/PVA体积比为1∶3的干燥水凝胶比表面积最小，为0.074 2 m2/g.

对照不同体积比例干燥水凝胶的SEM照片可以看出，WPU/PVA体积比例为1∶1的干燥水凝胶孔洞很大，而且三维网状结构不均匀，导致表面积小；WPU/PVA体积比例为1∶2的干燥水凝胶孔洞均匀，三维网状结构规律密实；WPU/PVA体积比为1∶3的干燥水凝胶的孔洞形态的形成是由于水凝胶中PVA含量的增加，从而使形成的微晶区以及交联点的数目增加，物理交联点之间的距离下降，网孔数量减少[23]，交联程度增加，空间结构收缩坍塌，导致比表面积减小.

图5 不同体积比例WPU/PVA水凝胶的比表面积

2.5 热性能分析

图6(a)为不同体积比例WPU/PVA水凝胶的热重曲线图；图6(b)为PVA、WPU、WPU/PVA水凝胶、RG-WPU/PVA水凝胶的热重曲线图.

在图6(a)中，WPU/PVA凝胶干燥样品有两个阶段的分解.第一阶段在250 ℃～370 ℃之间，为WPU的主链以及PVA侧链的分解；第二阶段在370 ℃～470 ℃之间，主要为WPU软段和PVA主链的分解.在失重5%时，部分样品的失重温度小于100 ℃，这是由于干燥后的多孔三维结构样品极易吸收水分，该部分质量损失是由样品中的水分挥发造成的.联合图6(a)与表1可知，WPU/PVA水凝胶干燥样品的最大热分解温度均在250 ℃～265 ℃之间.

(a)不同体积比WPU/PVA水凝胶的热重曲线

(b)PVA、WPU、WPU/PVA水凝胶、RG-WPU/PVA水凝胶的热重曲线.图6 水凝胶热重曲线

表1 不同体积比例WPU/PVA凝胶基体的热分解温度

表2 WPU/PVA水凝胶和RG-WPU/PVA水凝胶的热分解温度

2.6 结晶性能分析

图7为RG菌负载前后的WPU/PVA水凝胶以及原料的XRD谱图.由图7可知，WPU/PVA凝胶基体在2θ=19.8 °处呈现衍射峰，与WPU相比较峰型变窄，这是由于PVA与WPU形成了较为规整的分子间氢键，提高了其结晶性能；RG菌在2θ=19.7 °、2θ=31.8 °、2θ=45.3 °处分别呈现衍射峰，且峰型较宽泛，说明RG菌结晶性能很低；与WPU/PVA基体相比较，RG-WPU/PVA水凝胶分别在2θ=19.4 °、2θ=31.5 °、2θ=45.5 °处分别呈现衍射峰，峰型没有太大变化，说明RG菌成功的负载到凝胶上且基本不影响水凝胶的结晶性.

图7 RG-WPU/PVA水凝胶、WPU/PVA凝胶基体及原料的XRD谱图

2.7 水凝胶载菌量

实验中选取同批次培养至生长稳定期的RG菌液，分为两组，一组对照，一组加入制备的水凝胶，浸泡负载12 h后取出，分别测量空白组以及对应负载组在紫外吸收600 nm波长下的吸光度.对照图8所示的RG菌标准曲线，计算出负载前后的菌液浓度，根据负载前后的浓度差值，即可计算出水凝胶负载的菌量，具体数值如表3所示.

图8 嗜酸乳杆菌标准曲线

表3 不同体积比例WPU/PVA水凝胶载菌量

对应比表面积数据可以看出，比表面积越大，微生物的可附着面积也越大，进而负载量也增大.

2.8 载菌水凝胶的释放与动力学研究

为了研究水凝胶载菌后的释放情况，选取载菌量最佳的WPU/PVA体积比例为1∶2的载菌凝胶在缓冲溶液中研究其释放行为.分别利用Langmuir和Freundlich模型对微生物释放量进行伪一阶和伪二阶数据分析.伪一阶和伪二阶动力学模型分别如公式(1)、(2)所示：

(1)

(2)

式(1)、(2)中：qe为微生物释放平衡时的释放量；qt为t时刻是微生物的释放量；k1、k2分别为Langmuir和Freundlich模型中微生物释放速率常数.

(a)RG菌释放曲线

(b)伪一阶动力学方程曲线

(c)伪二阶动力学方程曲线图9 RG菌释放曲线

由图9(a)所示的RG菌释放动力学曲线可知，载菌水凝胶能在40 min内快速达到释放平衡； 由图9(b)可知，拟合伪一阶动力学线性相关性R2大于0.96，说明RG菌在释放过程符合伪一阶动力学方程，该过程为物理脱附过程；拟合伪二阶动力学线性相关性R2在为0.005，说明该过程不符合二阶动力学方程，没有化学作用参与脱附过程.

2.9 载菌凝胶的抗菌试验

采用抑菌圈法可初步验证载菌凝胶的抑菌效果.取稀释倍数为10-7的大肠杆菌溶液0.1 mL涂布于固体培养基上，将WPU/PVA体积比例为1∶2的负载RG菌的水凝胶切片放入，培养12 h，其结果如图10所示.由图10可知，在培养条件下，负载RG菌的WPU/PVA水凝胶能够在凝胶周围释放出RG菌，并对大肠杆菌的生长起抑制作用，形成抑菌圈.

图10 RG-WPU/PVA水凝胶的抑菌圈实验

3 结论

本研究制备出了以静电力与氢键附着嗜酸乳杆菌的新型水凝胶.研究结果显示，菌与凝胶之间的作用力提高了水凝胶的热稳定性；比表面积越大，载菌量越大；菌种释放过程符合伪一阶动力学模型，属于物理脱附；RG-WPU/PVA水凝胶能释放RG菌，并对大肠杆菌的生长起抑制作用.